SPARC 敲除通過調節(jié)肝臟脂質代謝影響代謝相關性脂肪肝相關肝癌發(fā)展的研究

常業(yè)飛 鄭盛 胡滔 洪穎 鐘勇 張曉珺

作者單位：650011 云南省第三人民醫(yī)院檢驗科

肝細胞癌 (HCC) 是全球第六大常見癌癥，也是全球癌癥相關死亡的第三大原因[1]。預計世界上最常見的 HCC 潛在病因將是代謝相關性脂肪肝，超過酒精和病毒性肝硬化[2]。脂質代謝的改變已被認為是癌癥的標志之一，因為不受限制的脂肪生成為癌細胞提供了足夠養(yǎng)分，使其不受控制地增殖[3]。最近的證據(jù)表明，癌細胞的代謝變化會增加小鼠肥胖模型的致癌作用[4]。最近的一項研究表明，甾醇調節(jié)元件結合蛋白 1c (SREBP1c)是脂肪生成基因轉錄的主要調節(jié)因子，有助于HCC進展[5]。與此一致，HCC 細胞中 SREBP1c 的抑制引起肝細胞癌停滯和細胞凋亡，而SREBP1c的過表達會增加細胞增殖[6]。盡管脂質代謝改變在肝癌發(fā)生背后的分子機制仍不清楚，但這些發(fā)現(xiàn)表明，脂肪生成增加是HCC進展的驅動力。富含半胱氨酸型酸性蛋白(SPARC)是一種參與不同生物過程的蛋白質，包括組織更新、對損傷的傷口愈合反應、組織重塑和纖維化[7]。此外，在病態(tài)肥胖NAFLD患者和飲食誘導NAFLD小鼠的樣本中，SPARC肝臟表達增加與更明顯的肝損傷和纖維化相關[8]。然而, SPARC 在代謝相關性脂肪肝相關肝癌發(fā)展中的作用仍未闡明。本研究進一步探討SPARC表達對代謝相關性脂肪肝相關肝癌的影響及其作用機制，旨在為進一步研究提供一定依據(jù)。

材料與方法

一、樣本來源

SPF級、雄性大鼠34只，8月齡，體質量400～450 g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2020-0004。

二、主要試劑

鏈脲佐菌素，購自中國上海如吉生物科技公司；TRIzol 試劑，購自賽默飛世爾科技；天狼星紅/天狼猩紅染色液試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；油紅O染色試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；DyNAmo HS SYBR Green qPCR試劑盒購自賽默飛世爾科技；鼠抗 SREBP1等單克隆抗體，購自艾美捷科技有限公司；等。

三、主要儀器

血細胞計數(shù)器(上海上碧實驗儀器有限公司)；Couvter型高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；DM 750型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；Spectra Max M5型多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)；定量PCR儀器(賽默飛世爾科技)；分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；RM2235型石蠟切片機(德國Leica公司)等。

四、方法

(一) 大鼠實驗 體內實驗利用雄性SPF級大鼠和SPARC基因敲除大鼠生成 STAMTM 小鼠模型，以研究NASH背景下的HCC發(fā)展。注射皮下劑量 (200 μg) 鏈脲佐菌素。并連續(xù)4周進行高脂肪飲食喂養(yǎng)，16周后安樂死，并評估腫瘤大小。高脂肪飲食成分：酪蛋白酸鈣 (200 g/kg)、維生素混合物 (10 g/kg)、纖維素 (50 g/kg)、動物脂肪 (250 g/kg)、維生素 A (1 mL/kg)、酒石酸氫膽堿 (2.5 g/kg)、麥芽糖糊精 (451.5 g/kg)。本研究經(jīng)我院動物研究委員會審查和批準。

(二)體外實驗方案 通過膠原酶灌注從對照組和研究組大鼠中分離肝細胞。肝細胞在不含酚紅的10% 胎牛血清中培養(yǎng)(每組17份)。培養(yǎng)2 d后將細胞與不同濃度1 mM的游離脂肪酸 (FFA)、2:1油酸和棕櫚酸的混合物孵育過夜，16 h后進行實驗。

(三)病理分析 肝腫瘤和非腫瘤組織固定在10%甲醛溶液中并包埋在石蠟中。確定肝實質內的腫瘤區(qū)域。對于肝纖維化評估，肝臟切片用天狼星紅染色，并按照 Camino 等的描述對膠原纖維進行定量。新鮮肝組織在最佳切割溫度化合物中冷凍，并用油紅O及蘇木精伊紅染色進行脂質分析。

(四)細胞染色 原代肝細胞培養(yǎng)物使用油紅O染色用于脂質分析。使用100%異丙醇提取染料，并使用分光光度計在510 nm處測量吸光度以量化細胞內脂質含量。

(五)蛋白質印跡分析 大鼠肝臟組織用1 mL組織裂解緩沖液裂解，在冰浴中在玻璃研磨機中研磨成勻漿，然后4 ℃裂解30 min，離心20 min。將十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，5%牛血清白蛋白封閉1 h，用PBS洗滌5 min。隨后，將膜與以下一抗一起孵育：鼠抗SREBP1在4 ℃下過夜。然后用PBS沖洗膜5次(每次5 min)，然后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG在室溫下孵育1 h。接下來，將膜浸入增強型化學發(fā)光溶液。在無光條件下顯影后，觀察條帶并拍照。

(六)逆轉錄定量聚合酶鏈反應 將細胞培養(yǎng)物或鼠肝臟腫瘤和非腫瘤組織均質化，并使用TRIzol試劑提取總RNA。使用500 ng Oligo (dT) 引物，用200 U SuperScript II逆轉錄酶逆轉錄 RNA(2 μg)。對cDNA進行qPCR。PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LXRα、CPT1、LIPIN、ACADSB 和 ACOX1 mRNA 水平通過SYBR Green qPCR進行量化。使用相對定量方法(2-ΔΔCt)計算SPARC、PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LxRα、CPT1、Lipin、ACADSB和ACOX1相對于GAPDH的mRNA表達。

(七)代謝標記和脂質分析 細胞培養(yǎng)完成后收獲前將細胞與2 μCi/mL [U-14C]-甘油孵育1、2 和 3 h。計數(shù)后，細胞在無菌PBS中洗滌并進行脂質提取。通過薄層色譜法(TLC)分離脂質種類。通過與相應的標準品和保留因子進行比較來鑒定不同的脂質種類。摻入甘油磷脂 (GPL) 和脂肪酸和中性甘油脂 (GL-TAG) 的放射性通過放射自顯影進行可視化，并通過閃爍計數(shù)進行量化。

(八)甘油三酯定量測定 將大約0.1 g的肝組織樣品與1 mL氯仿/甲醇 (2:1) 溶液均質化。低速離心后轉移到另一管中并在氮氣流下干燥，樣品溶解在100 μL異丙醇中，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗測量異丙醇中的膽固醇和甘油三酯水平。

(九)細胞細胞凋亡評估 將分離的原代肝細胞 (3×103) 接種到96孔板上，并使用1 mM的游離脂肪酸處理，通過吖啶橙-溴化乙錠混合物染色評估與細胞凋亡相關的形態(tài)學變化。從四個獨立的實驗中計數(shù)至少100個細胞，并確定活細胞、凋亡細胞和壞死細胞的百分比。

五、統(tǒng)計學方法

結 果

一、SPARC的缺失會增加脂肪變性并引起大鼠代謝相關性脂肪肝相關肝癌發(fā)生

在第16周時，兩組所有大鼠均發(fā)展為肝癌，且研究組肝癌平均直徑(1.39±0.14)mm顯著高于對照組(1.01±0.09)mm；NAS評分顯示，研究組大鼠脂肪變性評分(2.71±0.25)分顯著高于對照組(1.55±0.19)分，研究組小葉炎癥評分(0.74±0.09)分顯著低于對照組(1.27±0.11)分。HE染色結果顯示，研究組大鼠門靜脈炎癥減弱(見圖1)；天狼星紅染色結果顯示，研究組大鼠肝臟纖維化病變高于對照組(見圖2)。

注：左至右分別為對照組、研究組

注：左至右分別為對照組、研究組

二、SPARC敲除引起肝細胞脂質含量增加

體外研究中，油紅O染色結果顯示，研究組細胞脂質沉積增加，且GL-TAG、GPL表達顯著高于對照組(見表1、圖3)。

表1 兩組油紅O染色及GL-TAG、GPL表達比較

注：左至右分別為對照組、研究組

三、SPARC敲除引起肝細胞甘油三酯合成增加

體外實驗顯示，研究組肝細胞中[U-14C]-甘油表達顯著高于對照組(見表2)。

表2 兩組細胞不同時間[U-14C]-甘油表達比較(pomL/106)

四、SPARC敲除通過上調脂肪生成酶刺激肝臟脂質代謝

體外實驗發(fā)現(xiàn)，研究組PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LXRα、CPT1、LIPIN、ACOX1 mRNA表達顯著低于對照組(P<0.05)，兩組ACADSB mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

五、SPARC敲除增強肝細胞增殖活性

吖啶橙-溴化乙錠染色結果顯示，研究組細胞活力高于對照組，細胞存活率(97.89±1.44)%顯著高于對照組(48.47±1.21)%。見圖4。

注：左至右分別為對照組、研究組

表3 兩組PPARγ2、PPARα、CD36、FABP4、FABP5、ACC1、FASN、SREBP1、LxRα、CPT1、Lipin、ACOX1 mRNA表達比較(2-ΔΔCt)

六、SPARC敲除誘導SREBP1c核易位

免疫熒光檢測結果顯示，研究組細胞增加肝細胞中SREBP核定位，蛋白印跡實驗結果顯示，研究組AMPK、α-Tubulin蛋白表達低于對照組(見圖5、圖6)。

注：左至右分別為對照組、研究組

注：左至右分別為對照組、研究組

討 論

在這項工作中，我們證實了SPARC的缺失會增加肝細胞中的脂質沉積，并且SPARC在調節(jié)肝臟脂質代謝方面具有關鍵作用[9]。研究組肝細胞顯示出脂滴含量增加和脂質轉運蛋白基因(CD36、FABP4、FABP5)、脂肪生成基因(FASN、ACC1、SREBP1)和參與β-氧化和TG合成的基因 (LIPIN1)的更高表達。此外，在研究組肝細胞中觀察到TG合成增加。我們進一步研究了脂質超載對肝細胞的影響，并觀察到與對照組小鼠相比，研究組肝細胞在游離脂肪酸中顯示出更高的細胞活力、增殖和抗凋亡能力。最后，我們證實了在 NAFLD-HCC模型中敲除SPARC會加速 HCC的發(fā)展。RNA-seq研究表明，在研究組大鼠中，與脂質代謝、細胞解毒和增殖相關的通路上調。SPARC在多種組織中表達，發(fā)揮多種重塑和代謝功能[10]。在脂肪組織中，SPARC 抑制脂肪生成可能是因為刺激Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制脂肪生成轉錄因子，包括CAAT/增強子-結合蛋白α (C/EBPα)、CAAT/增強子結合蛋白β (C/EBPβ) 和過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)。在骨骼肌中，SPARC 充當代謝增強劑和運動介質，另一方面，研究組小鼠隨著年齡的增長和高脂肪飲食條件出現(xiàn)嚴重的葡萄糖穩(wěn)態(tài)改變[11-12]。因此，觀察到的脂質沉積增加可能與脂肪生成增加及葡萄糖穩(wěn)態(tài)改變相關。

有研究指出，SREBP1介導的脂肪生成途徑和SREBP1c的高表達與肝癌的不良預后相關[13]。此外，抑制SREBP1c核易位可抑制DEN誘導的HCC生長。本研究中觀察到 SPARC 的缺失或抑制會增加 SREBP 定位在肝細胞核中， SPARC 可能與 AMPK 相互作用，SPARC 對 SREBP 細胞定位的影響可能是通過調節(jié)AMPK活性來介導的。本研究中，研究組大鼠SPARC敲除后，AMPK激活明顯減少。周源[14]證實SPARC是一種AMPK相互作用蛋白，可能通過AMPK激活參與調節(jié)代謝。因此，筆者推測SPARC可能直接或間接與AMPK相互作用，阻止其活化從而調節(jié)脂質代謝。

脂肪生成是增強癌癥最重要的代謝標志之一[15]。脂肪酸促進了與癌細胞發(fā)育、進展和存活相關的重要過程[16]。脂肪生成的變化在致癌過程的早期開始，并隨著腫瘤細胞變得更具侵略性而進一步擴大。脂質代謝失調和肝臟中TG 的積累是代謝相關性脂肪肝的關鍵基礎，代謝相關性脂肪肝是一種會增加肝癌發(fā)展風險的疾病。脂質代謝重編程被認為是非酒精性脂肪性肝炎相關肝癌中的一個重要基礎[17]。因此，需要確定代謝相關性脂肪肝背景下參與肝癌發(fā)生的新途徑。為了進一步研究非酒精性脂肪肝環(huán)境中SPARC介導的代謝改變，我們在研究組小鼠中使用了非酒精性脂肪肝-肝癌模型。結果顯示，與對照組相比，SPARC敲除導致肝臟脂質沉積加速，脂肪變性增加及纖維化。然后，我們在 16 周后評估了大鼠肝癌的發(fā)展，并觀察到研究組大鼠顯示出肝癌加速生長。Atorrasagasti等[18]報道在裸鼠皮下接種時，SPARC在HCC 細胞中的過表達導致其致瘤性降低，部分是通過誘導間充質到上皮的轉化。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，研究組大鼠肝癌進程加快，并且與肝臟炎癥和纖維化程度降低有關?？紤]到患有脂肪變性的肥胖患者HCC發(fā)病率正在穩(wěn)步增加，我們的研究結果可能具有重要意義。但本研究仍有不足，如本研究中大鼠雖在短時間內發(fā)展為HCC，但與人非酒精性脂肪性肝炎進展為肝癌的緩慢病程具有差異，且多數(shù)肥胖患者伴有胰島素抵抗和2型糖尿病，本研究并未對此進行造模對比。此外，鏈脲佐菌素可能對肝細胞具有獨立的致癌作用，因為據(jù)報道它是一種破壞DNA的烷化劑。但本研究所獲取結果仍具有較高參考價值，對進一步闡明SPARC與關鍵脂質代謝蛋白相互作用機制的研究具有參考意義。

綜上所述，SPARC敲除可通過調節(jié)大鼠脂質代謝、細胞活力及肝細胞內脂質積累增加等途徑影響代謝相關性脂肪肝相關肝癌發(fā)展。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。