人肝癌細胞MHCC-97L組蛋白乙?；稽c修飾水平變化的研究

張建棟 李梁和 程海玉 姜洞彬 楊勤 詹瑋

作者單位：550004 貴陽 貴州醫科大學臨床醫學院(張建棟，姜洞彬)；貴州醫科大學附屬腫瘤醫院胃腸外科(李梁和)；貴州醫科大學附屬醫院肛腸外科(程海玉，詹瑋)；貴州醫科大學病理生理學教研室(楊勤)

肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，最新一項流行病學調查顯示，亞太地區肝臟疾病死亡的患者中43.6%為肝癌患者，高于美國33.9%及歐洲地區39.4%[1]。由于肝臟結構和功能特殊性，肝癌早期確診和就診率不高，是肝癌病死率偏高和5年生存率較低的原因之一[2-4]。肝癌的發生、發展被認為與異常的組蛋白乙?；揎椝疥P聯密切，在肝癌細胞組蛋白H3的肽鏈結構中，位于第9位的賴氨酸常常發生乙酰化修飾 (histone H3 lysine 9 acetylation, acH3K9) 異常，而關于肝癌細胞組蛋白H3K14、H3K18、H3K27位點的乙?；揎椀难芯旷r有報道。本實驗旨在探索人肝癌細胞株MHCC-97L中組蛋白乙?；揎椀南嚓P位點的變化情況，以期了解相關位點組蛋白乙酰化與肝癌發生之間的相關性，旨為臨床肝癌的早期診療和藥物靶點設計和藥物開發提供參考。

材料與方法

一、細胞株及主要試劑

人正常肝細胞株LO2及人低轉移性肝癌細胞株MHCC-97L由貴州醫科大學病理生理實驗室保存；胎牛血清、DMEM培養基購自Gibco公司；DNaseⅠ、彩虹Maker購于Solarbio公司；細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BAC蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、AlexaFiuor488標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、DyLight549標記山羊抗兔IgG(H+L)均購自上海碧云天公司；E-Plate檢測板購自埃森生物有限公司；acH3K14、acH3K18、acH3K27抗體購于Abcam公司，低速多管架自動平衡離心機TDZ-WS，購于湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

二、主要方法

(一)體外細胞培養 復蘇人正常肝LO2細胞及人低轉移性肝癌MHCC-97L細胞，分別置于含青、鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM培養基中培養(溫度37 ℃，CO2體積分數5%)，根據細胞生長狀態，及時進行培養基換液，細胞傳代，取對數生長期細胞用于實驗研究。

(二)RTCA檢測細胞增殖情況 向E-Plate檢測板中加入培養基并測定背景阻抗值；向相同培育條件下的兩組E-Plate檢測板中加入適量狀態良好的人正常肝LO2細胞或人低轉移性肝癌MHCC-97L細胞，室溫超凈臺內放置30 min；后置于37 ℃、CO2體積分數為5%、飽和濕度的培養箱，于培養箱中予RTAC xcell-Ligence動態觀察對數增長的LO2細胞或MHCC-97L細胞，進行實時動態的細胞增殖檢測并將二者的增長曲線繪制成圖。

(三)免疫熒光實驗對比細胞凋亡情況 分別取對數生長期的人正常肝LO2細胞、人低轉移性肝癌MHCC-97L細胞于培育皿中孵育培養，培養48 h后使用Annexin V-FITC/PI雙染法，順序加入Annexin V-FITC結合液15 μL/皿，Annexin V-FITC 5 μL/皿，PI 10 μL/皿，室溫搖床避光孵育20 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態，分析細胞凋亡情況。

(四)提取細胞核及核蛋白制備 通過核漿分離技術提取人正常肝LO2細胞及人低轉移性肝癌MHCC-97L細胞核蛋白，按每1×106個細胞比率加入裂解液100 μL，核蛋白酶抑制劑1 μL，冰上裂解30 min，以60 g轉速低溫離心10 min，-80 ℃下保存待用[5]。

(五)Western Blot檢測組蛋白乙酰化位點修飾情況 將提取的核蛋白分別置入120 g/L的SDS-PAGE中電泳，使用甲醇濕法電轉移法，轉膜，PVDF膜室溫下以5%脫脂奶粉搖床封閉2 h；加入單克隆抗體(一抗，分別采用組蛋白乙?；揎椢稽cH3K14、H3K18、H3K27抗體1:1000及H3抗體1:400)，4 ℃下低溫過夜；加入TBS洗滌液，洗膜后3～4次，再放入用TBS(按1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗)，于室溫下搖床上反應1 h進行標記；TBS洗滌液洗膜，加入曝光液，進行化學發光法顯色，曝光后以H3為內參，通過Image Lab圖像軟件定量分析H3K14、H3K18、H3K27組蛋白條帶灰度值，對比其乙?；揎椝?。

三、統計學方法

用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差表示，對數據進行t檢驗或相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、人正常肝細胞株LO2與人低轉移性肝癌細胞株MHCC-97L細胞形態圖比較

在相同的生長條件下培養，人低轉移性肝癌細胞株MHCC-97L細胞核體積大，呈多形性，核分裂增多。

注：A.LO2(×200)；B.MHCC-97L(×200)

二、人正常肝細胞株LO2與人低轉移性肝癌細胞株MHCC-97L兩種細胞株增殖對比

根據RTCA結果顯示，在相同條件下，培養初期人低轉移性肝癌細胞株MHCC-97L與人肝細胞株LO2均保持一定的增殖速度，MHCC-97L細胞株增殖速度高于LO2細胞株，兩組細胞株增殖數目均與時間呈正比。隨培養時間的推移，LO2細胞株增殖速度逐漸下降，相同條件下培育48 h后，人肝細胞株LO2細胞指數趨于穩定，而人低轉移性肝癌細胞株MHCC-97L有無限增殖趨勢，增殖速度明顯大于LO2細胞株(P<0.05，見表1)。

表1 兩組細胞株細胞指數水平隨培養時間增加的對比(±s, n=3 )

三、細胞凋亡情況

經Annexin V-FITC/PI法染色后，凋亡早期的細胞，細胞膜會被綠染，熒光顯微鏡下觀察發現，正常LO2細胞、MHCC-97L細胞48 h后自然凋亡情況差異不大。

注：A.LO2；B.MHCC-97L

四、LO2與MHCC-97L細胞acH3K14、acH3K18、acH3K27位點乙?；稽c修飾水平

通過Western Blot法檢測分析，與LO2細胞株相比，MHCC-97L細胞株中acH3K14、acH3K18、acH3K27位點乙?；揎椇蟮牡鞍琢勘磉_較正常細胞株更低，差異有統計學意義(P<0.05，見圖3及表2)。

表2 兩組細胞株間acH3K14、acH3K18、acH3K27相對表達水平的比較(H3, ±s, n=6 )

討 論

肝癌早期檢出率不高，多數患者被確診為肝癌時已達晚期[5]，提升早期診斷率與治療途徑，是肝癌防治的艱巨任務。國內外研究[6-8]陸續證實，肺癌、乳腺癌、前列腺癌及甲狀腺癌患者中乙?；慕M蛋白表達低于同類正常人，組蛋白乙?；揎椝降漠惓Ｊ前┌Y發生、發展的潛在通路。

圖3 Western blot檢測LO2與MHCC-97L的acH3K14、acH3K18、acH3K27位點乙酰化修飾情況

針對肝癌細胞中組蛋白乙?；揎椝綄Ω伟┻M展的影響，研究表明人肝癌細胞中H3組蛋白乙?；矫黠@低于人正常肝細胞[9]，且已有學者通過對手術切除肝癌組織的研究發現，人肝癌組織的H3組蛋白乙?；矫黠@低于臨近的非癌變的正常肝臟組織[10]。肝臟組蛋白H3乙?；较抡{與肝癌發生相關，有學者預測這可能是組蛋白H3乙?；浇档?，間接導致抑癌基因轉錄的沉默而誘導肝癌發生[11-12]。組蛋白乙?；揎椂喟l生在H3組蛋白賴氨酸殘基上的9、14、18、23位點[13]，國內學者張婷[14]通過免疫共沉淀實驗鑒定出人肝癌細胞中組蛋白H3K9位點的乙?；捷^人正常肝細胞低。學者Wang等[15]通過人正常肝細胞、人肝癌細胞、人肝癌轉移細胞系進行對比研究，結果證實人肝癌細胞組蛋白H3乙?；磉_下調，肝癌轉移細胞表達水平較肝癌細胞的H3乙?；?。關于肝癌發生、發展過程中具體哪些位點發生變化，以及這些位點的變化與腫瘤發生的關系罕見報道，尚無報道證實轉移性人肝癌細胞中組蛋白H3K14、H3K18及H3K27位點修飾水平的變化情況。

本研究以人正常肝細胞株LO2為對照，對比研究低轉移性肝癌細胞株MHCC-97L的組蛋白乙?；剑琖estern Blot法檢測acH3K14(組蛋白H3位于第14位的賴氨酸發生乙?；揎?，histone H3 lysine 14 acetylation)、acH3K18、acH3K27修飾水平是否存在異常。研究結果顯示相比正常肝細胞株LO2，低遷移肝癌細胞株MHCC-97L的acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾水平出現明顯下調，提示以上位點組蛋白乙?；揎椝降南抡{程度可能與肝癌細胞的發生有關，這與已有相關肝癌組蛋白乙?；难芯烤哂幸恢滦?。組蛋白乙酰化與去乙酰化之間保持動態平衡，特定位點組蛋白乙酰化修飾水平的改變，也可激活或沉默基因的轉錄[16]，這一特性為腫瘤早期的臨床診療和藥物開發提供了一種思路。國外學者已通過實驗證實，組蛋白修飾水平的異常發生在肝癌早期[17]，通過檢測H3組蛋白特定位點如K36甲基化修飾的表達水平，可對肝癌的生物學特征如血管浸潤程度、異質性及分化程度等情況進行判斷[18-19]，使得從表觀遺傳分子水平進一步診治肝癌成為可能。本研究對于肝癌組蛋白特定位點乙?；礁淖兊奶接懣山沂舅鼈冊诟伟┌l生中的作用，且有可能為肝癌早期診斷提供新思路，有助于尋找防治肝癌的可能靶點。

肝癌的發生是多因素參與的復雜過程，本研究探討了肝癌細胞中相應組蛋白修飾位點乙?；淖兓闆r，acH3K14、acH3K18及acH3K27修飾水平下調與肝癌發生存在關聯，而是否可通過改變上述組蛋白位點的乙?；接绊懜伟┘毎麪顟B，仍需進一步的實驗證實。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。