高危型人乳頭瘤病毒感染宮頸癌組織中N-myc下游調節基因1蛋白表達及其臨床意義分析

張云珠，王宇華，王梅，張愛，葉文鳳，陶萍萍

上海市浦東新區人民醫院婦產科，上海 201299

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤疾病，嚴重威脅女性健康及生命安全。已有研究發現，單一高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌患者的主要感染類型，且與病理組織類型和分化程度有關[1]。不少病情相似的宮頸癌患者根治術后生存結局有較大的差異，推測存在某些影響宮頸癌患者預后的重要因素。N-myc下游調節基因1（N-myc downstream regulated 1，NDRG1）是近年發現的一種新基因，定位于人染色體9q24.3，廣泛分布于人體多種組織中，已經被發現在卵巢癌[2]、子宮內膜癌[3]等女性生殖系統腫瘤組織中存在異常表達并參與疾病的發生發展過程，推測其對宮頸癌的發生發展及預后等方面也存在一定影響，但目前相關研究涉及較少。本研究探討高危型HPV感染宮頸癌組織中NDRG1蛋白表達及其與患者臨床特征和預后的關系，為預后預測、治療方案優化等提供更多可靠的參考指標，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2017年1月在上海市浦東新區人民醫院接受治療的高危型HPV感染宮頸癌患者的病歷資料。納入標準：①術中病理明確為原發性宮頸癌；②符合手術指征，完成術后放化療；③全程配合治療及隨訪；④臨床資料完整。排除標準：①合并其他原發惡性腫瘤；②合并基礎性嚴重心肝腎功能不全、自身免疫性疾病、血液系統疾病；③既往心腦血管病史、精神疾病；④妊娠期或者哺乳期女性；⑤臨床標本污染。根據納入、排除標準，共納入50例高危型HPV感染宮頸癌患者作為宮頸癌組。另選取同期在上海市浦東新區人民醫院進行治療的50例高危型HPV感染宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者作為CIN組，所有CIN患者均行宮頸錐切術并經病理證實且臨床資料完整。兩組患者的年齡、病程、體重指數、孕次及產次比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

表1 兩組患者的臨床特征（±s）

表1 兩組患者的臨床特征（±s）

臨床特征年齡（歲）病程（年）體重指數（kg/m2）孕次產次宮頸癌組（n=50）47.82±7.17 5.43±1.62 21.56±1.68 1.65±0.35 1.42±0.28 CIN組（n=50）46.21±5.64 5.68±1.43 21.98±1.95 1.59±0.39 1.34±0.27

1.2 免疫組化法檢測NDRG1蛋白表達情況

宮頸癌組織、CIN組織石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，熱抗原修復，3%過氧化氫孵育10 min，然后加入鼠抗人NDRG1單克隆抗體（1∶400稀釋），4℃恒溫過夜，滴加過氧化物酶標記二抗（1∶2000稀釋），孵育60 min后加入二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑顯色，蘇木素復染1 min后梯度乙醇分化30 s，氨水返藍1 min，乙醇脫水，中性樹膠封片。

每個切片隨機選取5個高倍視野觀察NDRG1陽性染色情況，NDRG1定位于細胞質與細胞核，呈棕黃色、淡黃色、棕褐色染色，依據染色程度、陽性細胞百分比評估陽性情況。染色程度：0分（無著色）、1分（淡黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色）；陽性細胞百分比：0分（無陽性細胞）、1分（陽性細胞百分比≤10%）、2分（10%＜陽性細胞百分比≤50%）、3分（50%＜陽性細胞百分比≤80%）、4分（陽性細胞百分比＞80%）。染色程度評分×陽性細胞百分比評分＞4分為陽性。

1.3 術后隨訪及預后評估

術后對所有宮頸癌患者進行長期隨訪，隨訪形式包括門診復診及電話，終點事件為患者全因死亡。以術后第1天作為隨訪起點，2021年1月1日或者該日期前患者終點事件出現作為隨訪終點。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況比較采用Log-rank檢驗；多因素分析采用Cox回歸分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NDRG1蛋白表達情況的比較

宮頸癌組患者宮頸癌組織中NDRG1蛋白陽性表達率為70.0%（35/50），高于CIN組患者CIN組織中的48.0%（24/50），差異有統計學意義（χ2=5.002，P=0.025）。

2.2 不同NDRG1蛋白表達情況高危型HPV感染宮頸癌患者臨床特征的比較

NDRG1蛋白陽性表達與NDRG1蛋白陰性表達高危型HPV感染宮頸癌患者年齡、腫瘤最大直徑、組織學類型、分化程度、肌層浸潤深度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；NDRG1蛋白陽性表達與NDRG1蛋白陰性表達高危型HPV感染宮頸癌患者國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、宮旁侵犯情況、淋巴結轉移情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

2.3 不同NDRG1蛋白表達情況高危型HPV感染宮頸癌患者預后的比較

Kaplan-Meier生存曲線顯示，NDRG1蛋白陰性表達高危型HPV感染宮頸癌患者生存情況優于NDRG1蛋白陽性表達患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 NDRG1蛋白陰性表達（n =15）與NDRG1蛋白陽性表達（n =35）高危型HPV感染宮頸癌患者的生存曲線

2.4 高危型HPV感染宮頸癌患者預后影響因素分析

將高危型HPV感染宮頸癌患者預后作為因變量（生存=0，死亡=1），將單因素分析中差異有統計學意義的指標（包括FIGO分期、宮旁侵犯、淋巴結轉移、NDRG1蛋白表達）納入多因素Cox回歸分析，結果顯示，FIGO分期為Ⅲ期、合并宮旁侵犯、合并淋巴結轉移、NDRG1蛋白陽性表達均是高危型HPV感染宮頸癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。（表 2）

表2 高危型HPV感染宮頸癌患者預后影響因素的單因素及多因素分析

表2 不同NDRG1蛋白表達情況高危型HPV感染宮頸癌患者臨床特征的比較

3 討論

NDRG1與細胞增殖及分化、腫瘤發生均密切相關，且已在多種常見惡性腫瘤組織中發現存在NDRG1表達改變，提出NDRG1可能成為腫瘤治療的新靶點[4-6]。最新動物研究發現，放療、化療及放化療可引起小鼠宮頸癌組織中NDRG1表達量降低[7]，推測治療前宮頸癌組織中NDRG1表達情況可能與病情等相關。本研究發現高危型HPV感染宮頸癌患者的宮頸癌組織中NDRG1蛋白陽性表達率上升，這與該分子在結直腸癌[8]、膽囊癌[9]等惡性腫瘤組織中的表達變化趨勢吻合。

后續在高危型HPV感染宮頸癌組織中NDRG1蛋白表達情況與臨床特征分析中發現，NDRG1蛋白陽性表達與NDRG1蛋白陰性表達高危型HPV感染宮頸癌患者FIGO分期、宮旁侵犯情況、淋巴結轉移情況比較，差異均有統計學意義。FIGO分期、宮旁侵犯、淋巴結轉移均是臨床公認的影響惡性腫瘤病情及進展的臨床特征，上述結果提示高危型HPV感染宮頸癌患者NDRG1蛋白表達情況可能在提示疾病嚴重程度方面具有重要意義。分化程度在惡性腫瘤病情中的影響也較為重要，但是本研究中NDRG1蛋白陽性表達與NDRG1蛋白陰性表達高危型HPV感染宮頸癌患者分化程度比較，差異無統計學意義，可能與納入的高危型HPV感染宮頸癌患者病例數較少、兩組間低分化例數差異未得到有效呈現有關，后續可擴大樣本量進一步明確其影響。

高危型HPV感染宮頸癌患者的術后5年生存率仍不理想[10-12]，鑒于NDRG1蛋白表達情況與臨床特征的關系，本研究分析不同NDRG1蛋白表達情況的高危型HPV感染宮頸癌患者術后生存情況的差異，結果發現，NDRG1蛋白陰性表達患者的生存情況優于NDRG1蛋白陽性表達患者，提示NDRG1蛋白陽性表達可能導致高危型HPV感染宮頸癌患者術后預后不佳。進一步多因素Cox回歸分析也證實，NDRG1蛋白陽性表達是高危型HPV感染宮頸癌患者預后的獨立危險因素。NDRG1蛋白陽性表達通過何種途徑左右高危型HPV感染宮頸癌患者的術后生存結局尚不明確。在其他疾病中對NDRG1的作用途徑研究有部分開展，如林簡等[13]的研究指出，NDRG1通過調控磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路對皮膚鱗狀細胞癌細胞凋亡產生影響。李婷和李赟[14]發現，過表達NDRG1通過調控WNT/β-catenin信號通路促進滋養層細胞上皮-間充質轉化。在高危型HPV感染宮頸癌患者中，NDRG1高表達可能也通過相似途徑影響腫瘤細胞的惡性行為并最終對患者術后生存結局產生影響，關于具體途徑的探索有待后續基礎及臨床研究深入開展明確。

綜上所述，高危型HPV感染宮頸癌患者宮頸癌組織中NDRG1蛋白陽性表達率較高，與患者臨床特征、預后等均密切相關，可能是高危型HPV感染宮頸癌發病、進展的重要分子之一，也對后續同類疾病的不良預后預測及治療方案制訂等提供參考意見，具有一定臨床價值。