骨折愈合中誘導H型血管形成因素的研究進展*

向煒 黃山峻 曹家全 陳孝均 劉安銘 吳佳奇

骨折愈合是一個時空調控的再生過程，理想情況下骨折可完整恢復且沒有纖維瘢痕形成[1]。目前，骨折的治療已取得了巨大進展，但仍有5%～10%的骨折因為治療不當或其他原因導致骨折延遲愈合，甚至不愈合。從骨折愈合的機制研究發現，除了軟骨區域外，骨是高度血管化、代謝活躍的組織[2]，血管生成和骨生成相互耦合[3]，從而維持正常骨的形態和功能。近年來，骨科領域發現了一種可成骨并促進骨折愈合的動脈分支亞型（H 型血管），是一種高表達血小板-內皮細胞黏附分子（PECAM-1/CD31）和內皮黏蛋白的毛細血管，主要分布在骨內膜和干骺端，周圍有豐富的Osterix+骨祖細胞、成骨細胞等，可以增加骨量，加速骨形成[4]。眾所周知，血管再生在骨折愈合中起著關鍵作用，血管的形成將為骨折愈合提供充足的氧氣和營養物質、分泌活躍生長因子及轉運代謝產物，從而增強血管和成骨細胞間的通信，加強血管和成骨耦合[5]。骨折后的前2 周是血管生成-成骨耦合的關鍵窗口，在此過程中新生血管的生長對骨折愈合起了不可替代的作用。因此，在骨折愈合窗口期使用H 型血管誘導劑促進H 型血管形成，恢復骨折處血供，這將是一種促進骨折愈合的可靠的治療新方法。本文旨在綜述誘導H 型血管形成的因素并歸納其可能形成的主要機制，為骨折愈合相關研究提供一個新的視角。

1 藥物因素

1.1 去鐵胺（DFO）DFO 是一種低氧模擬劑，已被FAD 批準用于治療輸血鐵過量疾病，其不僅可用于治療缺血性疾病，還可作為脯氨酸羥化酶抑制劑（PHDi）和血管生成興奮劑。在移植BMSCs 的大鼠中，使用去鐵胺模擬組織缺氧環境發現，去鐵胺可通過增強SDF-1/CXCR4 信號軸通路功能促進BMSCs 靶向歸巢，加速BMSCs 在缺血組織中的分化，促進缺血皮瓣血管化，增加皮瓣缺血缺氧處細胞因子的表達，從而改善局部血流，減少壞死面積，有助于骨折處血管的生成及周圍損傷組織的修復[6]。還發現去鐵胺可以穩定HIF-1α 的表達，激活PI3K/AKT 信號通路，上調下游SDF-1、VEGF等因子的表達從而有效地促進EPCs 向損傷處遷移、靶向歸巢，提高缺血組織血管化[7]。去鐵胺不僅可通過促進骨內H 型血管形成改善骨密度[8]，還在牽張成骨和小鼠股骨骨折愈合過程中發現可提高骨的再生能力。在愈傷組織部位，去鐵胺螯合鐵觸發血管生成，可以抑制HIF-1α 的脯氨酸羥基化，使HIF-1α 積累，引起核易位、二聚作用與HIF-1β，反式激活VEGF 和其他下游介質的新血管的形成，因此，注射去鐵胺可以部分挽救切除卵巢小鼠受損的H 型血管[9]。在體外，去鐵胺已被證明可以促進血管生成[10]，在動物模型骨折部位連續注射去鐵胺時可增強骨痂新生血管生成，從而改善骨生成。去鐵胺通過刺激HIF-1α 表達促H 型血管增殖，以H 型血管聯合生成大量成骨轉錄因子Osx 為中心的高代謝成骨分化區域，可有效促進節段性骨缺損修復[11]。有研究首次發現羥基紅花黃色素A（HSYA）與DFO 聯合用藥，上調HIF-1α 分泌，促進糖尿病大鼠創面新生血管相對細胞聚集，使傷口內形成更多的血管，從而加速創面修復[12]。因此，去鐵胺促進血管成骨耦合機制可以歸納為主要通過調節HIF-1α 引起下游細胞分子的集連反應，進一步促進血管成骨耦合。回顧文獻發現將DFO 與生物支架聯合用于促進骨折愈合可能也是一種很好的治療方法。最近有DFO 在人體內的首次應用報道[13]，即將可植入式血管生成/成骨刺激劑HA-DFO，用于骨折后血管生成關鍵時期內，將DFO 緩慢釋放至骨折部位。作者主要是對一名繼發于放療后上頜發育不全的年輕患者進行治療，發現DFO 通過上調HIF-1α 途徑間接刺激血管生成從而使治療區域的骨面積和骨密度增加，因此，可推測植入式緩慢釋放去鐵胺將會取得好的臨床療效，但其具體效果如何、具體注入體內時間、劑量等仍需要實驗進一步研究。綜合現有實驗研究發現：DFO 可通過調節HIF-1α 有效促進H 型血管生成和成骨，有利于骨折后血供的建立從而促進骨折愈合，但其具體治療的標準仍需大量實驗深入研究。

1.2 雷帕霉素 雷帕霉素是一種免疫抑制劑，最早用于器官移植以減輕排斥反應，后來發現也是一種有效的自噬誘導劑，近年來在實驗研究中也發現有促進血管和骨生成的作用，可能會對H 型血管的形成也有很大的促進作用。有關骨質疏松的研究表明：鐵積聚可通過mTOR/STAT1/Cxcl9 通路損害骨質疏松癥的骨再生，鐵積聚激活mTOR，而雷帕霉素作為mTOR 抑制劑，可改善骨丟失，促進高轉換型骨質疏松癥的血管生成和成骨，從而增加骨量[14]。雷帕霉素可促進骨折部位血管的生成，促進成骨細胞的分化，抑制破骨細胞的分化，從而在成骨和骨保護中發揮重要作用[15]，而且還可以通過抑制mTOR活性進而增強細胞自噬活性，抑制細胞凋亡，調節骨折部位血管生成，加速骨折的有效愈合[16]。新近研究表明，在脊髓橫斷后，將聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）微球從施萬細胞（SC）負載的帶正電荷的富馬酸聚乙二醇支架中持續釋放雷帕霉素，可使軸突再生的能力增強并改善脊髓功能，促進新生血管的正常化[17]。但也有研究發現不同濃度的雷帕霉素對骨愈合有不同的影響：使用中、低劑量的雷帕霉素可改善血管的數量、長度和表面積[18]；如果持續或過多使用雷帕霉素將會抑制骨折愈合[19]，研究發現高劑量雷帕霉素可通過過度的抗增殖作用、自噬或抑制VEGF 的產生而損害血管形成或抗血管生成[17]，使血管數量、長度和表面積下降到未植入細胞或藥物時的水平。在骨折部位血管的生成和成骨中發現，持續過多的雷帕霉素劑量將會抑制血管生成使骨折延遲愈合，甚至不愈合；適當的劑量將會促進血管生成從而加速骨折愈合。很顯然，不同劑量的雷帕霉素和/或不同實驗對象以及雷帕霉素的不同分子的作用機制都會對骨和血管的作用有不同的影響，因此，雷帕霉素雖然有研究表明可促進血管和成骨耦合，但其具體機制有待進一步研究。

1.3 紅景天苷 藏藥紅景天具有活血化瘀、通脈止痛、扶正固本和補腎強身等功效。現代研究表明：紅景天含有40 多種化合物，主要成分為紅景天苷、酪醇等，具有抗缺氧、抗病毒、抗衰老以及神經系統的雙向調節作用[20]。研究發現，紅景天可以促進骨折部位血管新生以及對成骨具有保護作用，其中紅景天苷（salidroside，SAL）是最重要的成分，具有上調成骨細胞骨形態發生蛋白2（BMP2）促進骨生成，在低氧和常氧條件下，SAL 對血管內皮細胞的增殖、遷移及成管都有明顯的促進作用。SAL 通過調節HIF-1α 信號通路改善骨折部位血供，促進骨折部位血管和新骨的形成，并且可以很大程度改善骨的力學性能、韌性和強度，同時SAL 被證實可通過上調HIF-1α 信號通路，促進其下游靶基因VEGF 表達促進胎鼠跖骨的血管新生[21]，能直接和間接誘導ECs 的增殖、遷移和毛細血管結構的形成，并在胎鼠長骨中產生血管生成活性因子，通過HIF-1α 介導的VEGF 誘導骨組織血管生成，促進血管和骨生成的偶聯[22]，并可以有效上調bFGF、VEGF 等細胞因子的表達，誘導血管新生，改善成骨細胞的供血供氧狀態，促進成骨細胞的分化成熟，調節骨代謝動態平衡，最終骨化形成骨組織[23]。紅景天苷作為中藥紅景天里的重要成分，對骨折部位血管形成具有重大的促進作用，其機制大致歸納為：一可直接上調骨形態發生蛋白2 促進成骨；二通過調節HIF-1α，使下游靶基因VEGF 等細胞因子充分表達，從而調節H 型血管形成，促進血管成骨耦合。紅景天苷的臨床應用有利于發揮中醫藥對骨折愈合的作用，但其促進H 型血管形成的具體機制有待進一步實驗確認。

1.4 其他藥物 在骨折局部使用氯化錳，使骨痂中細胞內和/或細胞外VEGF-A 和VEGF-C 的增加，從而增加骨折骨痂處骨膜下血管生成，促進成骨[24]。層粘連蛋白α4 鏈功能肽修飾脫鈣骨基質支架材料可促進血管內皮祖細胞的黏附并顯著促進H型血管的生成，從而在骨缺損修復中實現血管生成和骨再生的有效耦聯[25]。中成藥骨疏康（GSK）可通過增強HIF-1α 的表達誘導H 型血管并促進骨形成[26]。目前H 型血管形成機制不唯一，除了通過增強HIF-1α 的表達誘導H 型血管并促進成骨之外，還有通過促進PDGF-BB 分泌增加，從而促進H 型血管形成，誘導成骨。黃芪總黃酮（TFRD）在大鼠牽張成骨（DO）模型中可通過PDGFBB/PDGFR-β代替HIF-1α/VEGF 軸，加快H 型血管形成，并增強血管成骨耦合[27]。在骨質疏松小鼠模型中發現，注射肉葉蕓香堿（harmine）后可抑制破骨前細胞向破骨細胞的融合，使破骨前細胞和CM 中分泌的PDGF-BB 顯著增加，使小鼠骨質中PDGF-BB 濃度和H 型血管數量明顯增加[28]。不同藥物誘導H 型血管形成雖然有個例報道，但其研究的實驗支持較少，具體的促進H 型血管形成機制不唯一，因此其誘導H 型血管促進骨折愈合的機制仍值得我們進一步研究。

2 物理因素

2.1 超聲 目前，研究超聲在骨愈合過程中的作用已經很普遍，尤其是低強度脈沖超聲。低強度脈沖超聲可以在細胞水平誘導機械力，而且已被證實可以調節血管和骨的形成[29]。從數學模型解釋超聲的作用發現，超聲在血管生成中起關鍵作用，可加速血管生成，縮短骨愈合時間[30]。例如，在大鼠創傷性椎體骨折模型中發現，低強度脈沖超聲可通過在時間和空間上增加軟骨形成，誘導成骨細胞成骨以及促進H 型血管生成來加速創傷性椎體骨折愈合[31]；在體外和體內HADSC/HUVEC 共培養中，使用低強度脈沖超聲可以增強血管生成，制備的膠原聯合Col/0.5HA 支架以及低強度脈沖超聲應用于干細胞與內皮細胞共培養體系中，可有效促進血管生成[32]。研究發現低強度脈沖超聲處理可以激活YAP/TAZ，并將其轉位到細胞核中激活靶基因，該過程可以被siYAP 滅活，被shLATS1/2 激活，通過低強度脈沖超聲治療，與Hippo 通路的交叉作用啟動血管生成，從而促進骨折愈合[33]。在使用低強度脈沖超聲對13 名腓骨延遲愈合患者的研究中發現，血管大小和類骨質體積之間有顯著的相關性，在腓骨延遲愈合患者的骨中，低強度脈沖超聲增加血管體積，使延遲愈合中類骨質體積增加，從而增加骨折部位血液供應和灌注[34]，促進血管生成和骨折愈合。超聲作為一種無創、無痛苦、便捷、價廉的方法，對骨折愈合具有顯著的競爭力，雖然目前已有相當多的實驗研究，但其具體促進血管成骨耦合的機制有待進一步實驗研究，具有深遠的研究價值。

2.2 機械應力 力學環境影響骨折愈合過程中的組織血管化，機械不穩定力較穩定力更能促進早期血管生成和骨修復[35]。文獻[36]表明，血管重建和骨形成依賴于碎片間運動的方向，其中循環壓迫最能促進血管重建從而刺激骨愈合過程。因為循環機械載荷不僅對細胞行為（如增殖、遷移和分化）有直接影響，還對改變生化和生物物理環境有間接影響，在骨愈合早期，適度的運動會改善無血管化骨折血腫細胞或血管化不足的早期肉芽組織內的供氧，從而促進血管生成和骨折的愈合[37]。通過離體實驗發現，機械牽張力能夠通過調控成骨細胞促進相關血管生成因子的分泌[38]，在牽張成骨（DO）實驗過程中發現，形成的骨和血管比單純骨折愈合過程中更多，因此機械牽拉應力有利于血管生成和成骨[27]。雖然有相關文獻論述機械應力能夠促進骨折部位血管生成以及成骨，但其具體機制仍然有待進一步實驗研究。機械應力的改變，一方面可能會刺激骨折斷端與周圍組織的接觸，從而促進周圍相關細胞因子的分泌和活躍；另一方面可能是通過機械應力的改變使周圍血管收縮，加快血流速度，促進周圍各種細胞因子的轉運以及獲得足夠的營養物質，為進一步促進血管生成和成骨提供機會。

3 展望

大量研究表明H 型血管可以協調成骨細胞和破骨細胞譜系細胞之間的細胞信號傳導，并產生促進骨祖細胞增殖和分化的因子，促進骨愈合。作為一種新發現的動脈分支的毛細血管亞型，H 型血管在骨折愈合中的形成將會為骨折部位提供充足的氧氣、營養物質，傳輸成血管和成骨生長因子以及排出代謝產物，使血管生成和成骨處于動態平衡之中，從而加快骨折愈合。通過回顧文獻發現：（1）目前關于H 型血管在骨折愈合中形成的研究較多，但多處于動物實驗階段，在臨床實驗中不多，個體差異較大，需要更加深入的進行實驗研究，以便進一步驗證H 型血管形成的機制，為進一步靶向治療提供確切指導。（2）通過歸納H 型血管在骨折愈合中形成的誘導因素發現：藥物中去鐵胺誘導H 型血管形或成為重要因素；H 型血管形成的主要機制可能是通過調控HIF-1α，激活下級靶細胞因子相關作用，從而促進血管生成和成骨。（3）超聲和機械應力均是一種無創、痛苦小、便捷、價廉的方法，適合大眾人群，可行性較高，但具體機制有待進一步實驗驗證。

綜上所述，H 型血管形成的誘導因素主要集中在藥物、超聲和機械應力方面，但缺乏系統的歸納，且已有相當多的綜述論述H 型血管的形成機制，但促進H 型血管形成的最主要機制尚不明確，通過對H 型血管在骨折愈合中形成的誘導因素進行回顧發現：目前主要可能誘導因素為DFO；H 型血管形成的機制主要可能是HIF-1α 信號通路。本文雖然不能對所有已知的誘導因素進行全面的論述，但筆者希望通過對涉及H 型血管在骨折愈合中形成的誘導因素回顧，找到主要可能誘導因素，并找到促進H型血管在骨折愈合中形成的主要可能機制，為骨折愈合的相關研究提供一個新的視角。