外泌體miRNA-3651水平聯(lián)合雙源CT對(duì)非小細(xì)胞肺癌的診斷價(jià)值及與預(yù)后的相關(guān)性研究

虞云杰 王正磊 黎淑娟 李銘 趙娟 齊琳

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)作為肺癌最常見類型，在肺癌中占80%以上[1-2]。目前治療的主要方法為手術(shù)、放化療、靶向治療等[3]，但預(yù)后仍然不佳。及時(shí)發(fā)現(xiàn)與NSCLC發(fā)展有關(guān)因子并及早干預(yù)可能對(duì)預(yù)防或延遲肺癌進(jìn)展具有較好效果。微小RNA(microRNA，miRNA)在癌癥中影響疾病進(jìn)程并影響預(yù)后[4]，miR-3651在多種癌癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5-6]，但尚缺乏在NSCLC中相關(guān)研究。雙源計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)在腫瘤診斷、病理分級(jí)等多方面有較高應(yīng)用[7]，但在預(yù)測NSCLC轉(zhuǎn)移中報(bào)道較少。探究miR-3651聯(lián)合雙源CT對(duì)于NSCLC患者診斷及預(yù)后可能具有一定價(jià)值。因此，本研究以本院NSCLC患者為研究對(duì)象，觀察外泌體miR-3651、雙源CT與NSCLC患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與預(yù)后情況，為臨床上早期發(fā)現(xiàn)疾病轉(zhuǎn)移及預(yù)后提供一定參考。

資料與方法

一、臨床資料

收集2016年2月—2018年2月本院97例確診的NSCLC患者為研究對(duì)象，年齡37～68歲、平均年齡(50.23±6.79)歲，男58例、女39例，TNM分期：Ⅰ期44例、Ⅱ期53例，有吸煙史者61例。術(shù)前所有患者均行雙源CT掃描，采集外周靜脈血，所有患者1周內(nèi)均行肺癌根治術(shù)治療，根據(jù)病理診斷確定淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移組)52例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無轉(zhuǎn)移組)45例。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：NSCLC患者均符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)》中關(guān)于NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為原發(fā)性；(2)首次確診未治療患者；(3)預(yù)計(jì)生存時(shí)間>3個(gè)月；(4)資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受放、化療患者；(2)有肺癌或其它惡性腫瘤家族遺傳史；(3)合并其它惡性腫瘤疾病；(4)昏迷或意識(shí)不清患者。本研究患者或家屬知情并同意，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(電力倫審-2020-001)。

二、樣本收集及處理

血清收集：采集受試者外周靜脈血5 mL中，室溫靜置30 min，2000g離心10 min，上層血清層置于1.5 mL EP管中。差異超速離心法提取血清外泌體，-80℃保存待用。

三、試劑與儀器

引物序列(上海生工生物工程有限公司)；磷鎢酸鈉(山東西亞化學(xué)科技有限公司，貨號(hào)：A15391-25g)；BCA蛋白試劑盒(上海睿時(shí)生物科技有限公司，貨號(hào)：23225)；一抗CD63(碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)：AF1471)；一抗TSG101、GAPDH，二抗羊抗兔(英國abcam公司，貨號(hào)分別為：ab125011、ab8245、ab6721)；全外泌體RNA和蛋白分離試劑盒、RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(賽默飛世爾，貨號(hào)分別為：4478545、K1622)；2×SYBR qPCR Mix(北京莊盟國際生物基因科技有限公司，貨號(hào)：ZF101-1)。

透射電鏡(北京日立科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：HD-2700)；蛋白凝膠成像系統(tǒng)(上海恒勤儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：ZF-288)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR quantitative，RT-qPCR)儀(上海天能有限公司，型號(hào)：Tanon5200)；雙源CT掃描儀(德國西門子公司，型號(hào)：Somatom Defonotion Flash)。

四、外泌體的鑒定

透射電鏡鑒定外泌體：20μL外泌體加20μL 1×磷酸緩沖液稀釋，室溫靜置1 min晾干，吸取20μL 3%(w/v)磷鎢酸鈉溶液滴至銅網(wǎng)，銅網(wǎng)放置透射電鏡中抽真空，觀察外泌體形態(tài)并拍照。蛋白質(zhì)免疫印跡鑒定外泌體：BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳分離、NC轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，添加一抗CD63、TSG101、GAPDH，4℃孵育過夜；添加對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1h，DAB顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照和定量分析。

五、 RT-qPCR法檢測外泌體中miR-3651水平

全外泌體RNA和蛋白分離試劑盒提取外泌體中RNA，RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。引物序列miR-3651上游引物：5′-CATAGCCCGGTCGCTGGTACATGA-3′、下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，內(nèi)參U6上游引物：5′-CTAGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。20μL反應(yīng)體系：2×SYBR qPCR Mix 10μL，35 ng/μL cDNA 2μL，上/下游引物(10 μM)各0.5 μL，ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件：95℃、30s；95℃、15s，60℃、60s，共40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-3651相對(duì)表達(dá)水平。

六、雙源CT掃描

雙源CT掃描儀采用雙筒高壓注射器、經(jīng)肘靜脈注射300mg I/mL碘海醇(碘對(duì)比劑)。掃描參數(shù)：雙能增強(qiáng)掃描采用Liver VNC序列，A、B球管管電壓分別為100kV、Sn140kV，參考管電流時(shí)間乘積分別為300mA·s、232mA·s。將動(dòng)靜脈期增強(qiáng)掃描圖像調(diào)入Siemens Syngo MMWP VE40A工作站雙能軟件中，經(jīng)Liver VNC模式得到碘圖；混合圖像經(jīng)Syngo-via工作站MM Oncolohy后處理軟件三維體積測量得病灶形態(tài)學(xué)信息。由2名放射科醫(yī)生采用雙盲法獨(dú)立處理及測量各項(xiàng)參數(shù)，劃定最大感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，碘圖上測量病灶及病灶同層面大血管碘覆蓋值、碘濃度值及標(biāo)準(zhǔn)化碘濃度(normalized iodine concentration，NIC)。再利用“Monoenergetic”程序得40keV-190keV之間感興趣區(qū)的CT值，得到NLCLC病灶各單能量條件下的CT值和衰減曲線，分別計(jì)算靜脈期和動(dòng)脈期能量曲線斜率。

七、隨訪

從2016年2月28日，開始隨訪3年，截止日期為2021年2月28日，生存(生存組)36例、死亡(死亡組)61例，無失訪病例。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、外泌體的鑒定

透射電鏡觀察外泌體大小80～150 nm，呈杯口狀(見圖1A)；蛋白質(zhì)免疫印跡鑒定CD63、TSG101均表達(dá)(見圖1B)。

圖1A 透射電鏡下外泌體形態(tài)

圖1B 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測外泌體中CD63、TSG101表達(dá)情況

二、 NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與外泌體miRNA-3651水平、雙源CT指標(biāo)關(guān)系

與無轉(zhuǎn)移組相比，轉(zhuǎn)移組外泌體miR-3651水平、雙源CT指標(biāo)碘濃度、NIC、動(dòng)脈期斜率均升高(P<0.05)(見表1)。

表1 兩組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與外泌體miRNA-3651水平、雙源CT指標(biāo)比較

三、外泌體miR-3651水平、雙源CT指標(biāo)對(duì)NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值

ROC曲線顯示，外泌體miR-3651水平預(yù)測NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積為0.908(0.848～0.968)，截?cái)嘀禐?.39，其敏感性為76.9%、特異性為97.8%；雙源CT聯(lián)合檢測ROC曲線下面積0.821(0.738～0.904)，敏感性為80.80%、特異性為73.3%；聯(lián)合預(yù)測NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積為0.971(95% CI:0.941～0.999)，敏感性為92.3%、特異性為91.1%(見圖2)。

圖2 外泌體miR-3651水平、雙源CT指標(biāo)對(duì)NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

四、患者生存情況與外泌體miRNA-3651水平、雙源CT指標(biāo)關(guān)系

與生存組相比，死亡組外泌體miR-3651水平、雙源CT指標(biāo)碘濃度、NIC、動(dòng)脈期斜率升高(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組患者生存情況與外泌體miRNA-3651水平、雙源CT指標(biāo)比較

五、影響NSCLC患者預(yù)后因素分析

將NSCLC患者預(yù)后生存與否為因變量(生存=0，死亡=1)，將年齡(實(shí)際值)、性別(女=0，男=1)、TNM分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1)、吸煙史(無=0，有=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0，有=1)、外泌體miR-3651(實(shí)測值)、碘濃度(實(shí)測值)、NIC(實(shí)測值)、動(dòng)脈期斜率(實(shí)測值)為自變量進(jìn)行Cox分析。多因素分析顯示，校正年齡、性別、TNM分期、吸煙史及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響后，外泌體miR-3651、雙源CT指標(biāo)NIC、動(dòng)脈期斜率是NSCLC患者預(yù)后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見表3)。

表3 影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

討 論

肺癌在惡性腫瘤中位居首位，癌癥遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，也是絕大多數(shù)肺癌患者治療失敗的原因[9]。早期發(fā)現(xiàn)疾病有助于延長患者生存期[10]。因此尋找與NSCLC轉(zhuǎn)移、預(yù)后關(guān)系密切指標(biāo)對(duì)于緩解疾病、早期治療等具有較高價(jià)值。

miRNA幾乎可參與整個(gè)腫瘤過程，在腫瘤診治、靶向治療、預(yù)后等過程中均具有一定價(jià)值[11-12]。miR-3651在多種腫瘤中發(fā)揮作用，在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)降低可能是診斷生物標(biāo)志物[13]；miR-3651作為食管鱗狀細(xì)胞癌新型預(yù)后生物標(biāo)志物的臨床潛力指標(biāo)影響疾病[14]，但在肺癌相關(guān)疾病中尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。在本研究中，外泌體miR-3651在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移NSCLC中高表達(dá)。提示miR-3651可能在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，外泌體miR-3651水平預(yù)測NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積為0.908，截?cái)嘀禐?.39，其敏感性為76.9%、特異性為97.8%。miR-3651對(duì)NSCLC轉(zhuǎn)移具有一定預(yù)測價(jià)值。進(jìn)一步檢測miR-3651水平與預(yù)后生存關(guān)系，發(fā)現(xiàn)死亡患者外泌體miR-3651水平顯著高于生存患者，且是影響患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-3651可作為預(yù)后指標(biāo)，對(duì)于患者及早干預(yù)緩解病情具有較高意義。

雙源CT是因不同能量下物質(zhì)衰減特征不同，通過彩色編碼來顯示碘的分布，因此可通過碘濃度和碘覆蓋值反映病灶血流情況[15]。且雙源CT可通過影像學(xué)定量檢測，對(duì)于患者疾病狀況和臨床療效具有顯著診斷意義。在本研究中，雙源CT指標(biāo)碘濃度、NIC、動(dòng)脈期斜率在轉(zhuǎn)移組中均升高；由于NSCLC轉(zhuǎn)移過程中需要大量血供支持[16]，因此導(dǎo)致碘濃度、NIC水平升高。而碘攝取越多，曲線斜率越大，肺癌主要由支氣管動(dòng)脈和肺動(dòng)脈供血，隨著腫瘤不斷增大，血供亦不斷增大[17]。因此出現(xiàn)動(dòng)脈率斜率增大現(xiàn)象。雙源CT預(yù)測NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積0.821。雙源CT指標(biāo)具有預(yù)測NSCLC轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值，且NIC、動(dòng)脈期斜率是NSCLC患者預(yù)后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，故關(guān)注NSCLC相關(guān)指標(biāo)變化對(duì)于NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)測預(yù)后都具有一定價(jià)值。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-3651水平聯(lián)合CT預(yù)測NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積為0.971。外泌體miR-3651聯(lián)合雙源CT指標(biāo)對(duì)于NSCLC患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值較高，為臨床早期發(fā)現(xiàn)疾病及預(yù)后提供一定的參考價(jià)值。

綜上所述，miR-3651聯(lián)合雙源CT對(duì)于NSCLC患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后均具有一定影響，可為影像技術(shù)聯(lián)合miRNA指標(biāo)在NSCLC中的應(yīng)用做一定參考。但在本研究中受NSCLC例數(shù)限制，且患者預(yù)后與靶向治療、放化療，甚至免疫治療等密切相關(guān)，研究結(jié)果可能與實(shí)際情況存在偏倚，后續(xù)還需結(jié)合患者不同的TNM分期、分子分型等方面進(jìn)行遠(yuǎn)期隨訪，進(jìn)一步確定其臨床預(yù)測價(jià)值。