整合應(yīng)激反應(yīng)在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用

卓懷蜜 陳宋程 周向東,2 李琪,2

整合應(yīng)激反應(yīng)(integrated stress response,ISR)廣泛存在于真核細(xì)胞體內(nèi)，是維護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生存的重要適應(yīng)性機(jī)制，可被多種細(xì)胞應(yīng)激和病理?xiàng)l件激活，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、DNA損傷、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等[1-2]。該過程主要通過磷酸化真核生物起始因子2(phosphorylation of eukaryotic translation initiationfactor 2，p-eIF2)α亞基中的絲氨酸-51位點(diǎn)，阻斷鳥嘌呤核苷酸交換因子(The guanine nucleotide exchange factor)eIF2B的作用，抑制細(xì)胞內(nèi)翻譯，減少蛋白質(zhì)的總體合成，并激活下游轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)調(diào)控相關(guān)應(yīng)激基因，如CHOP、GADD34等的表達(dá)參與氨基酸代謝、未折疊蛋白反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過程[3-4]。這一機(jī)制依賴于四種不同的eIF2α激酶：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase，PERK)、一般控制非抑制因子2(general control non-depressible protein 2，GCN2)、RNA依賴性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)、血紅素調(diào)節(jié)的eIF2α激酶(heme-regulated eIF2a kinase，HRI)，每種激酶感知和響應(yīng)不同的應(yīng)激源[4]。PERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的I型跨膜蛋白激酶，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有較高的敏感性。PERK可以通過整合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激另兩條信號(hào)途徑：需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme-1，IRE1)和轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)途徑，參與調(diào)控蛋白質(zhì)合成、降解、細(xì)胞自噬與凋亡[5]；GCN2能使細(xì)胞對氨基酸缺乏做出反應(yīng)，降低細(xì)胞對氨基酸的消耗，同時(shí)在營養(yǎng)不良的環(huán)境中將資源轉(zhuǎn)化為氨基酸的生物合成[6]；PKR主要參與細(xì)胞內(nèi)抗病毒反應(yīng)，阻斷胞內(nèi)病毒的復(fù)制及蛋白合成[7]；HRI被認(rèn)為主要存在于紅細(xì)胞體內(nèi)，在血紅素濃度低下或鐵缺乏時(shí)被激活，調(diào)節(jié)血紅素與珠蛋白之間的平衡[8]。目前人們發(fā)現(xiàn)蛋白激酶并不僅僅只是被特定的一種應(yīng)激源所激活，而是能感應(yīng)不同應(yīng)激誘發(fā)ISR，且不同蛋白激酶反應(yīng)之間往往存在協(xié)同交互作用[9]。

近些年來，隨著對ISR研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)ISR不僅僅只是細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)機(jī)制，其還參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，衰老及與年齡相關(guān)的疾病通常與ISR的激活有關(guān)[10]，且通過調(diào)節(jié)ISR可以逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)缺陷導(dǎo)致的各種記憶、認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)退行性變[11]。而在心肌梗死中，ISR激活可保護(hù)心肌細(xì)胞免受再灌注損傷[12]。但在慢性主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的GCN2、PKR信號(hào)通路中，ISR的激活則會(huì)進(jìn)一步加重心臟功能的衰竭[13]。此外，ISR還與肝脂肪變性和糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)[14]。隨著ISR在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用被逐漸認(rèn)識(shí)到，它在呼吸系統(tǒng)中顯示出更加重要的作用。故本文主要就ISR在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制作一綜述，對象主要包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、肺結(jié)核(TB)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、阻塞性呼吸暫停綜合征(OSA)。

一、ISR在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用

(一)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)

靶向治療已成為目前治療NSCLC的一種有效方法，但近年來人們發(fā)現(xiàn)，許多NSCLC患者開始出現(xiàn)耐藥性[15]，尋找新的靶向治療點(diǎn)成為必然。PD-L1/PD-1是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在肺癌細(xì)胞中可以檢測到PD-L1的高表達(dá)，PD-L1通過結(jié)合T細(xì)胞膜上PD-1受體，抑制T細(xì)胞增殖，從而使腫瘤細(xì)胞躲避宿主免疫系統(tǒng)攻擊[16]。Suresh[17]等人通過對人非小細(xì)胞肺癌 H358細(xì)胞進(jìn)行全基因組CRISPR/Cas9篩選發(fā)現(xiàn)，在尿卟啉原脫羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase，UROD)缺失的NSCLC細(xì)胞中PD-L1蛋白的表達(dá)增加，且UROD是血紅素合成的關(guān)鍵酶。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血紅素缺乏通過活化HRI/eIF2α途徑激活I(lǐng)SR，ISR的激活促進(jìn)了PD-L1的依賴性翻譯，從而抑制CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)，促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的生長。

此外，腫瘤微環(huán)境一般被認(rèn)為處于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏狀態(tài)。為了抑制營養(yǎng)物質(zhì)缺乏激活的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞必須利用不同的適應(yīng)性反應(yīng)來躲避[18]。那么腫瘤細(xì)胞是如何逃避的呢？研究發(fā)現(xiàn)，在氨基酸缺乏時(shí)，KRAS基因突變的NSCLC細(xì)胞通過激活轉(zhuǎn)錄因子ATF4通路靶向調(diào)控天冬酰胺合成酶(asparaginesynthetase，ASNS)，ASNS通過調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cycling B1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,GCN2-eIF2α信號(hào)途徑協(xié)同參與此過程[19-20]。Ghaddar[21]等人近來的研究則進(jìn)一步明確了ISR在KRAS突變的肺腺癌細(xì)胞中的作用。實(shí)驗(yàn)表明，PERK/p-eIF2α臂通過抑制細(xì)胞內(nèi)雙特異性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6，DUSP6)的翻譯，增加細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(the extracellular signal-regulated kinase，ERK)的磷酸化表達(dá)以促進(jìn)應(yīng)激反應(yīng)下腫瘤細(xì)胞的存活和生長。DUSP6在人類肺腺癌細(xì)胞(lung adenocarcinoma cell,LUAD)中表現(xiàn)出抗腫瘤作用，其低表達(dá)與LUAD對絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)抑制的敏感性增加和預(yù)后不良有關(guān),這是KRAS突變腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。而該研究結(jié)果與臨床收集到的928例原發(fā)性肺腺癌患者的數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。與p-eIF2α陰性的患者相比，p-eIF2α陽性患者的預(yù)后更差，且p-eIF2α的表達(dá)增加與腫瘤局部侵襲性、腫瘤亞型和腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)。在腫瘤浸潤區(qū)域，p-eIF2α表達(dá)更高。因此，通過使用PERK抑制劑或ISR抑制劑阻斷p-eIF2α翻譯，可增加DUSP6的表達(dá)，降低ERK磷酸化，同時(shí)下調(diào)ATF4來抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

(二)肺結(jié)核

結(jié)核肉芽腫是結(jié)核病主要的病理特征表現(xiàn)，它的形成使得結(jié)核桿菌得以逃避機(jī)體免疫清除，從而進(jìn)一步傳播[22]。目前已證實(shí)，腫瘤壞死因子(TNF)是結(jié)核肉芽腫形成和維持以及結(jié)核耐藥性的重要細(xì)胞因子，且研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌毒力的增強(qiáng)和宿主對結(jié)核分枝桿菌的高易感性都與I型干擾素刺激基因(IFN-I-stimulated genes，ISG)的表達(dá)增加有關(guān)[23]。在結(jié)核病臨床診斷前18個(gè)月，感染結(jié)核分枝桿菌的潛伏結(jié)核病患者外周血中，可檢測到ISG表達(dá)上調(diào)，這表明ISG可能是活動(dòng)性結(jié)核的預(yù)測因子，且IFN-I途徑可能與活動(dòng)性結(jié)核的發(fā)病和疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[24-25]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在肺結(jié)核患者的壞死性肉芽腫中，可檢測到ISR標(biāo)記物表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)，特別是在靠近結(jié)核肉芽腫壞死中心的細(xì)胞層[26]。

近來，Bhattacharya[27]等人發(fā)現(xiàn)攜帶sst1易感(sst1S)基因型的小鼠在結(jié)核分枝桿菌感染后易出現(xiàn)壞死性結(jié)核肉芽腫，這與巨噬細(xì)胞對TNF的異常反應(yīng)和持續(xù)升高的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。sst1S巨噬細(xì)胞在TNF的持續(xù)性刺激下，早期反復(fù)誘導(dǎo)IFN-I途徑激活、疊加，在中晚期，結(jié)合內(nèi)源性胞質(zhì)PKR配體活化PKR信號(hào)通路，誘導(dǎo)eIF2α磷酸化觸發(fā)ISR而后續(xù)激活I(lǐng)SR相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如ATF3、CHOP、TRB3和DDIT4，從而引起巨噬細(xì)胞死亡和組織壞死，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受損，這可能與結(jié)核病活動(dòng)性進(jìn)展有關(guān)。因此，通過特異性阻斷TNF介導(dǎo)的IFN-I和ISR反應(yīng)，將有可能成為治療結(jié)核病中壞死性肉芽腫的有效手段。

(三)慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘

慢阻肺特征性病理表現(xiàn)為肺氣腫和慢性氣道炎癥。目前已知香煙暴露(cigarette smoking exposure，CSE)和由此產(chǎn)生的氧化應(yīng)激是COPD發(fā)展的主要因素之一，相關(guān)研究已經(jīng)證明氧化應(yīng)激通常可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，兩者相互作用促進(jìn)疾病進(jìn)展[28]。香煙煙霧所致的氧化應(yīng)激可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑(endoplasmic-reticulum-associated protein degradation，ERAD)中蛋白酶的活性及細(xì)胞自噬，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白與未折疊蛋白大量積累，加劇了侵襲性小體形成，是導(dǎo)致COPD肺氣腫形成和進(jìn)展的重要機(jī)制之一，而該過程與eIF2α磷酸化水平變化有關(guān)[29]。與未暴露于香煙煙霧的小鼠相比，暴露于香煙煙霧的小鼠肺裂解物中磷酸化eIF2α的表達(dá)增加了4倍[30]。在小鼠CSE誘導(dǎo)的急性模型中可檢測到PERK/eIF2α信號(hào)通路的表達(dá)，而在COPD嚴(yán)重肺氣腫患者中也發(fā)現(xiàn)磷酸化eIF2α的表達(dá)上調(diào)[31]。支氣管氣道上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜研究表明，在患有和不患有COPD的目前和以前的吸煙者中，ATF4介導(dǎo)的COPD相關(guān)病理改變的基因表達(dá)顯著增加[32]。因此，阻斷ATF4介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路可能是降低氣道疾病發(fā)病的方法。

Emily及其同事發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象，在利用銅綠假單胞菌感染支氣管上皮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌分泌的綠膿桿菌素和堿性蛋白酶除了介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)之外，這兩種毒素還對鐵具有高敏感性，鐵缺乏，將平行獨(dú)立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑激活HRI激酶觸發(fā)ISR，ISR通過翻譯轉(zhuǎn)錄因子ATF4誘導(dǎo)GADD34蛋白合成增加，GADD34的表達(dá)降低了細(xì)胞毒性并提高了細(xì)胞存活率，保護(hù)宿主免受銅綠假單胞菌的毒性作用，這意味著在慢性肺部疾病細(xì)菌感染期間，獨(dú)立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的ISR可能會(huì)提供一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[33]。

關(guān)于ISR在哮喘中的研究極少，目前研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者，血單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CHOP的誘導(dǎo)，而小鼠和細(xì)胞內(nèi)磷酸化eIF2α的表達(dá)增加，這提示ISR可能參與了哮喘的發(fā)病，但具體機(jī)制仍不清楚[34]。

(四)特發(fā)性肺纖維化(IPF)

IPF是一種病因未明、病死率較高的間質(zhì)性肺疾病，目前認(rèn)為IPF的發(fā)病與肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生反復(fù)損傷后的異常修復(fù)及持續(xù)的成纖維細(xì)胞活化、膠原和基質(zhì)沉積有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，長期暴露在高危因素，如吸煙、粉塵、生物燃料等刺激下可激活I(lǐng)SR。ISR通過活化PERK/eIF2α/ATF4信號(hào)誘導(dǎo)CHOP蛋白表達(dá)，介導(dǎo)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致上皮屏障再生修復(fù)不足，殘存細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)樣轉(zhuǎn)化，大量促纖維化因子的分泌，使成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，引起細(xì)胞外大量基質(zhì)沉積[34]。Burman[35]等人建立博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型，通過模擬局部缺氧環(huán)境并通過敲除小鼠CHOP基因證實(shí)，在缺氧的環(huán)境下，CHOP蛋白的表達(dá)能促進(jìn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar type 2 pneumocytes，AT2)的凋亡而加重肺纖維化。此外，CHOP可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型亞群分化，進(jìn)一步促進(jìn)肺纖維化形成。Anthea[36]等人在肺損傷后修復(fù)期，發(fā)現(xiàn)了一種肥大、多倍體的AT2細(xì)胞。這種AT2細(xì)胞是AT2干細(xì)胞向AT1細(xì)胞分化過程中由于胞質(zhì)分裂失敗產(chǎn)生的一種雙核型細(xì)胞。過多的多倍體AT2細(xì)胞將導(dǎo)致AT2干細(xì)胞子代的缺失，減弱其再生能力，影響肺損傷后修復(fù)。通過對受損的肺組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序分析顯示，AT2細(xì)胞向AT1細(xì)胞分化過程中表達(dá)與ISR相關(guān)的基因，且肺損傷在AT2細(xì)胞分裂、擴(kuò)大和分化修復(fù)肺泡上皮時(shí)持續(xù)激活I(lǐng)SR，增加了多倍體AT2細(xì)胞胞質(zhì)分裂失敗的易感性。在SARS-CoV-2肺炎引起的嚴(yán)重肺損傷患者當(dāng)中，一些患者會(huì)發(fā)展為持續(xù)性、進(jìn)行性的肺纖維化，在他們的肺組織中也發(fā)現(xiàn)了類似的細(xì)胞。因此，通過減弱肥大、多倍體肺泡上皮細(xì)胞的形成或持續(xù)時(shí)間有利于維持AT2細(xì)胞的再生能力及促進(jìn)肺修復(fù)。

(五)阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSA)

關(guān)于ISR在OSA中的研究甚少，目前研究發(fā)現(xiàn)ISR與OSA導(dǎo)致的代謝功能障礙有關(guān)。OSA以慢性間歇性缺氧(intermittent hypoxia，IH)為特征，一方面，IH不僅可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激激活I(lǐng)SR，觸發(fā)大量炎癥因子釋放，如IL-1、IL-6、IL-13等，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，且可誘導(dǎo)體內(nèi)白色脂肪組織(WAT)分解產(chǎn)生游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)，F(xiàn)FA可激活PERK依賴性轉(zhuǎn)錄因子IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)加重細(xì)胞炎癥反應(yīng)。另一方面，F(xiàn)FA大量產(chǎn)生，進(jìn)一步激活PERK信號(hào)通路，誘導(dǎo)CHOP蛋白表達(dá)，介導(dǎo)胰島B細(xì)胞凋亡，并通過整合IRE1/XBP1s通路，激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)、NF-κB等，共同導(dǎo)致胰島素信號(hào)通路受損，引起胰島素抵抗[37-38]。Khalyfa[39]等人發(fā)現(xiàn)，OSA小鼠體內(nèi)，IH可持續(xù)性激活并延長ISR周期。慢性ISR持續(xù)性激活PERK信號(hào)，加重脂肪炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗，引起糖尿病、血脂異常等并發(fā)癥的發(fā)生。

二、ISR藥物

目前已有針對ISR的藥物，包括激動(dòng)劑和抑制劑。ISR抑制劑包括eIF2α激酶抑制劑和ISRIB(Integrated stress response inhibitor)，是治療神經(jīng)退行性病變、腫瘤及代謝性疾病的重要手段。相關(guān)研究顯示，ISR抑制劑在治療與應(yīng)激顆粒(Stress Granuals，SGs)形成有關(guān)的神經(jīng)退行性病變方面具有神經(jīng)保護(hù)作用[40]。在呼吸系統(tǒng)方面，目前已明確選擇性PERK抑制劑GSK2606414和ISRIB能有效抑制小鼠肺腺癌細(xì)胞的增殖，具有抗腫瘤活性，且ISRIB在長期治療中，能持續(xù)性抑制ISR，并無明顯毒性副作用[21]。而選擇性PERK抑制劑GSK2656157似乎能通過阻斷血管生成來抑制體內(nèi)癌癥的生長[42]。ISRIB還可抑制小鼠體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌增殖和肉芽腫形成，改善小鼠肺部炎癥和壞死程度[27]。此外，ISRIB能減少多倍體AT2細(xì)胞的形成或持續(xù)時(shí)間，促進(jìn)肺纖維化小鼠AT2細(xì)胞向AT1細(xì)胞正確分化，加速上皮修復(fù)，減少促纖維化巨噬細(xì)胞的募集，改善肺纖維化[11,37]。

ISR激動(dòng)劑主要是通過激活eIF2α激酶或抑制eIF2α去磷酸化來實(shí)現(xiàn)，包括eIF2α激酶激動(dòng)劑及磷酸酶抑制劑。eIF2α激酶激動(dòng)劑可應(yīng)用于抗耐藥癌癥的治療，如選擇性PERK激活劑CCT020312，其可通過激活G1/S細(xì)胞周期點(diǎn)，增加腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性[43]。而磷酸酶抑制劑，如沙魯布林，研究發(fā)現(xiàn)其在缺血性疾病中具有保護(hù)作用[44]。此外，沙魯布林可保護(hù)氣道上皮細(xì)胞免受香煙誘導(dǎo)的凋亡和抑制氣道上皮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，保護(hù)小鼠免受肺氣腫的發(fā)展，是治療COPD的潛在新方法[45]。Sephin1是胍那芐衍生物，可選擇性抑制GADD34蛋白。研究顯示，Sephin1可抑制呼吸道合胞病毒(RSV)和人類腸道病毒(EV-D68)復(fù)制，但治療所需劑量過高，較易產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)，當(dāng)前尚未進(jìn)入臨床研究[42]。奈非那韋是臨床使用的一種抗HIV藥物，目前尚未明確其介導(dǎo)eIF2a磷酸化增加，從而激活I(lǐng)SR的確切作用機(jī)制[1]。

三、結(jié)語與展望

自David Ron[46]等人首次提出“整合應(yīng)激反應(yīng)(ISR)”這一概念以來，人們對于ISR在細(xì)胞內(nèi)的作用及與人類疾病關(guān)系的研究從未停止。目前許多研究已明確ISR與肺部疾病的相關(guān)性，大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果也凸顯了ISR在肺部疾病中的重要性。因此，以ISR激酶及其下游信號(hào)為靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，可能有助于延緩疾病進(jìn)展和改善臨床結(jié)果。但在此之前需要解決一些問題，我們需要考慮這些靶點(diǎn)和信號(hào)通路的穩(wěn)態(tài)活性，并在使用時(shí)進(jìn)行觀察和不斷調(diào)整，以便更明確地掌握它們對治療發(fā)展的影響。此外，細(xì)胞在不同應(yīng)激源刺激下針對不同ISR激酶作用進(jìn)行反應(yīng)調(diào)整，ISR信號(hào)在不同類型細(xì)胞之間的交叉、重疊，可能影響疾病的發(fā)病過程，這些需要進(jìn)一步的研究來闡明并確定。