外泌體IncRNA在肺癌中的研究進展

王嘉琪 岳紅梅,2 謝瑩瑩 魏雅倩 宋佩佩 劉南玉 魏繼芳

肺癌為起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，是全球范圍內導致癌癥相關死亡的主要原因。國際癌癥機構最新發布的GLOBOCAN數據顯示，2020年，全球估計新發癌癥患者19292789例，其中，肺癌的發病率達11.4%，排名第二，與排名第一的乳腺癌僅相差0.3個百分點；同時，肺癌死亡數占所有癌癥死亡數的18%，高居第一，近乎是位于第二的結直腸癌死亡占比的2倍。尤其在男性患者中，肺癌的發病率和死亡率均位居榜首[1]。盡管早期非小細胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC)可以通過手術治愈，不過有50%以上接受手術治療的NSCLC患者會在5年內復發。除此之外，由于臨床上缺乏高特異性的診斷標志物，高達70%的患者確診時已是晚期，無法手術治療。因此，肺癌的診治是腫瘤學領域的主要挑戰之一。

外泌體是機體包括腫瘤細胞在內的大多數細胞分泌的直徑30～150nm的細胞外囊泡，其通過攜帶和傳遞如MicroRNA (miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)、蛋白質等重要的信號分子，介導細胞與組織間或細胞間的物質運輸和信號傳遞。近年來大量研究表明，外泌體miRNA通過控制信號通路基因的表達，參與腫瘤轉移、腫瘤免疫調節、腫瘤血管生成及調節腫瘤耐藥，影響肺癌的發生發展，為肺癌臨床診治提供了新思路。然而，外泌體miRNA數量有限且表達缺乏特異性，限制了其在生物標志物中的廣泛應用[2]。越來越多的證據表明，外泌體IncRNA在包括疾病診斷、疾病的發生發展中具有顯著的潛力[3-4]。

lncRNA長度超過200bp，具有信號傳導、引導核糖核蛋白復合物和分子誘導等多種功能，但是由于其缺乏蛋白編碼能力[5]，且只有少數具有特定的功能，多年來未受到足夠重視。直到近幾年，lncRNA成為了一個新興的研究熱點，許多研究者發現lncRNA在某些生理情況及包括COPD、哮喘、腫瘤等眾多疾病中發揮重要作用[6]，尤其在腫瘤中，lncRNA通過染色質重塑和組蛋白修飾，表觀遺傳學修飾或通過“海綿”效應抑制miRNA，或與啟動子與轉錄因子結合從而干擾下游基因的表達，通過多種方式參與癌細胞的發展過程[7]。且與miRNA相比，它表現出更好的組織特異性。這些特點使它成為腫瘤新的潛在生物標志物。因此，本文將重點介紹外泌體lncRNA在肺癌診療中的最新研究進展。

一、外泌體IncRNA參與肺癌的血管生成和轉移

目前為止，肺癌無法根治主要原因是腫瘤細胞的侵襲性和遠處轉移，這均與上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)密切相關。EMT是發生在生理或病理情況下的、具有極性的上皮細胞向具有移行能力的間充質細胞發生轉化的現象。在早期腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞驅動EMT獲得間充質細胞的特征，并伴隨著跨越基底細胞和血管內皮細胞層的遷移能力，從而促進腫瘤轉移[8]。轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是最重要的EMT誘導因子之一，與相應的膜受體相互作用，激活各種EMT相關信號通路下游蛋白，進而促進腫瘤細胞的轉移潛能[9]。既往研究表明，TGF-β介導的外泌體miRNAs調控肺癌細胞的遷移和侵襲。近年來，大多數學者發現TGF-β介導的外泌體lncRNA，同樣與腫瘤的侵襲和轉移過程密切相關，Wu等[10]發現TGF-β介導的NSCLC來源的外泌體Inc-MMP2-2通過上調波形蛋白和N-cadherin表達，減少E-cadherin表達，促進基質金屬蛋白酶2(matrix Metallopeptidase 2,MMP2)表達水平，進而調控肺癌細胞向血管的遷移和侵襲。Zhang R.等[11]發現肺癌患者中血清外泌體MALAT-1可以使cyclinD1、cyclinD2和CDK的表達上調，促進細胞周期進展、減少細胞凋亡導致肺癌細胞的增殖和轉移，且MALAT-1水平與肺腫瘤分期和淋巴轉移呈正相關。此外，PI3K/AKT是惡性腫瘤中極其重要的分子通路之一，廣泛參與調節細胞增殖、分化、凋亡和遷移等。據報道，巨噬細胞中的一種具有磷脂酶活性的腫瘤抑制基因——M2極化同系物(PTEN)參與調控PI3K和AKT磷酸化，在肺癌血管生成中起關鍵作用[12]。對此Cheng等[13]體外實驗研究表明，低水平肺癌細胞源性的外泌體生長抑制特異性基因5(IncRNA GAS5)可以通過競爭性結合miR-29-3p，調節PTEN表達，影響人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中PI3K和AKT磷酸化，促進HUVEC的增殖，抑制凋亡，進而導致肺癌血管的生成。Mao等[14]也發現富含FOXD3AS1的外泌體通過與ELAVL1相互作用激活PI3K/Akt信號通路，促進肺癌細胞增殖、侵襲。

二、外泌體IncRNA在肺癌診斷中的作用

早診斷可以顯著提升肺癌患者的5年生存率、降低轉移風險、延長生存期，與疾病的預后密切相關。然而，早期診斷標志物的不足是導致肺癌患者預后不良的主要原因。現積累的證據表明，外泌體lncRNAs可作為肺癌診斷的有前途的生物標志物。如血清外泌體生長抑制特異性基因5(lncRNA GAS5)是最近發現的一種腫瘤抑制因子，涉及多種癌癥，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結直腸癌。研究發現NSCLC患者GAS5的表達水平低于健康受試者，低lncRNA GAS5表達使腫瘤細胞增殖能力增強，進而促進腫瘤進展[15]，且有新的研究證據顯示GAS5水平與NSCLC的TNM分期和腫瘤大小有關，晚期NSCLC患者的血清外體GAS5表達低于早期NSCLC患者。相關ROC曲線分析表明，外泌體GAS5診斷NSCLC的AUC、敏感性和特異性分別為0.857%、85.94%和70.00%。當血清外泌體GAS5與臨床指標CEA結合時，AUC提高至0.929。而且這種血清生物標志物(AUC 0.822，敏感性63.16%，特異性80.00%)在檢測早期NSCLC方面也顯示出比CEA(AUC 0.718，敏感性50.37%，特異性85.00%)更好的診斷能力[16]。另一項研究顯示外泌體IncRNA SOX2-OT在肺鱗狀細胞癌(Lung Squamous Cell Carcinoma,LSCC)患者中顯著上調，研究中作者評估了SOX2-OT在鑒別LSCC和非LSCC中的診斷價值，報道其AUC為0.82，敏感性和特異性分別為0.76和0.73。同樣，外泌體SOX2-OT水平與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結轉移顯著相關[17]。Zhang R.等研究報道，血清外泌體lncRNA MALAT-1在NSCLC患者中高表達，ROC曲線顯示，當檢測血清外泌體MALAT-1作為NSCLC的診斷生物標記物時，其AUC、敏感性和特異性分別為0.703、0.601和0.809[11]。最后，外泌體lncRNA OGFRP1被證實在NSCLC的患者中亦明顯升高，ROC曲線分析發現在NSCLC的早期診斷中，其診斷的靈敏性、特異性和準確性分別為0.905、0.869、0.939，顯著高于CEA[18]。

三、外泌體IncRNA調節肺癌耐藥

目前，對于晚期喪失手術機會的肺癌患者，放、化療和靶向治療為其帶來了新的希望，已成為NSCLC精準醫學的新方向，但是幾乎所有接受靶向藥物治療的NSCLC患者最終均不可避免出現獲得性耐藥現象。到目前為止，越來越多的證據表明，外泌體IncRNA通過調控相關信號通路的基因表達及通過與miRNAs相互作用，參與了肺癌細胞的獲得性耐藥。如研究[19-20]發現，敏感的腫瘤細胞攝取外泌體lncRNA RP11-838N2.4和lncRNA H19后可導致這些受體細胞分別對厄洛替尼和吉非替尼產生耐藥性。Mao等[14]研究表明外泌體IncRNA FOXD3AS1可抑制由5氟尿嘧啶(5-FU)引起的細胞凋亡，增加癌細胞對5-FU耐藥。Chen等研究[21]觀察到，在吉非替尼耐藥的NSCLC細胞中存在UCA1/miR-143/FOSL2軸。外泌體IncRNA尿路上皮癌相關基因1(UCA1)在耐吉非替尼的NSCLC細胞系中顯著上調，通過miR-143/FOSL2軸促進NSCLC細胞對吉非替尼的耐藥。Sun等[22]研究發現在小細胞肺癌組織中過度表達的癌細胞相關成纖維細胞(CAF)衍生的外泌體lncRNA母系表達基因3(MEG3)通過miR-15a-5p/CCNE1軸促進SCLC細胞的轉移、增強SCLC對順鉑的耐藥性。

此外，巨噬細胞在癌細胞的耐藥中亦發揮重要作用，它是一組異質性免疫細胞群，是腫瘤浸潤性免疫細胞的主要群體之一，可分化為兩種不同類型，包括M1巨噬細胞和M2巨噬細胞。在腫瘤微環境中，巨噬細胞表現出M2樣表型，定義為腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)，TAM是微環境中腫瘤進展的主要參與者和協調者。研究顯示[23]，高M2/M1巨噬細胞比率有助于癌細胞的增殖、轉移、侵襲和耐藥性。Zhou等[24]發現NSCLC細胞通過靶向調控miR-627-3p/Smads信號通路，將癌細胞衍生的外泌體IncRNA SOX2重疊轉錄本(SOX2-OT)轉移到巨噬細胞中，從而促進巨噬細胞M2極化，導致M2/M1巨噬細胞比率失調，增強自身EGFR-TKIs耐藥性。Deng等[25-26]進行的一系列研究表明M2XI型TAM衍生的外泌體lncRNA MSTRG.292666.16可能通過MSTRG292666.16/miR-6836-5p/MAPK8IP3軸促進NSCLC細胞對奧西替尼的耐藥性，并且在腫瘤細胞耐藥性傳播中發揮關鍵作用。Zhang F.等[27]研究發現對放療耐受的肺癌組織中M2巨噬細胞源性外泌體IncRNA AGAP2-AS1表達增加，其通過下調miR-296和過度表達NOTCH2來增強肺癌的放射免疫耐受。最近研究[28]表明，外泌體IncRNA SNHG7亦通過多種途徑誘導肺腺癌細胞對多西他賽產生耐藥性。首先，外泌體IncRNA SNHG7通過募集人類抗原R(HuR)以穩定自噬相關基因5(ATG5)和自噬相關基因12(ATG12)來誘導肺腺癌細胞中的自噬；其次，外泌體SNHG7通過募集Cullin4A觸發巨噬細胞M2極化，促進PTEN泛素化并激活PI3K/AKT通路，通過誘導肺腺癌細胞自噬和促進巨噬細胞M2極化來促進肺腺癌細胞對多西他賽的耐藥性。最后，他們發現對多西他賽耐藥的肺腺癌細胞可以通過分泌外泌體SNHG7來促進親本肺腺癌細胞對多西他賽的耐藥性。

四、外泌體IncRNA參與肺癌的免疫調節

腫瘤微環境(tumor microenvironment ，TME)是一個由成纖維細胞、免疫細胞、內皮細胞、基質細胞和細胞外基質組成的高度動態的復雜環境。在腫瘤的發生發展過程中，TME與腫瘤細胞的相互作用介導了腫瘤細胞的免疫耐受，從而影響了免疫治療的臨床效果。現有研究表明外泌體IncRNA可以通過影響腫瘤微環境中免疫細胞的功能，介導腫瘤細胞發生免疫逃逸，從而調控肺癌的發生發展。Jiang等[29]研究發現， CAF衍生的外泌體IncRNA OIP5-AS1通過抑制miR-142-5p的表達，減弱了miR-142-5p對PD-L1的抑制作用，使PD-L1表達上調，抑制單個核細胞誘導的肺癌細胞殺傷能力。最近也有研究顯示[30]，PD-1與免疫細胞上的PD-L1受體相互作用，導致T淋巴細胞凋亡，導致免疫逃逸。此外，研究[31]發現在發生轉移或者KRAS突變的腫瘤組織中，外泌體IncRNA PCAT-1的表達顯著上調，上調的外泌體lncRNA PCAT-1在腫瘤微環境中通過增加肺組織中免疫抑制性micrornasmiR-182/miR217的表達來調節KRAS相關的化療耐受性，與肺癌患者生存率降低和預后不良密切相關。下調PCAT-1可誘導T細胞募集和激活IL-13/IL-33介導的途徑，抑制CAF介導的基質成纖維細胞激活導致的腫瘤轉移，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性并影響腫瘤免疫細胞微環境。

五、小結展望

近年來，在大量研究的基礎上已證實外泌體lncRNAs作為基因表達的調控因子，介導細胞間通訊，通過特定機制參與多種疾病的發生發展。尤其在肺癌的早期診斷、腫瘤細胞的轉移、耐藥及免疫調節中具有重要的臨床價值。此外，其在肺癌的預后和為耐藥患者開發耐藥增敏劑方面的研究也正在進行中，如：Zhang F.等[27]發現在肺癌患者中外泌體LncRNA AGAP2-AS1高表達，則其OS和PFS較低，提示預后不良。Sun等[22]發現順鉑耐藥的肺癌患者中，miR-15a-5p的高表達或CCNE1的低表達均逆轉了外泌體IncRNA MEG3過度表達對SCLC化療耐藥性和細胞轉移的促進作用，因此提示MEG3/MiR-15a-5p/CCNE1軸可能為提高SCLC患者順鉑化療的臨床療效提供一種新的潛在治療策略。總之，上述各種研究發現可以為未來如何提高診斷和治療肺癌的效率提供一些獨到的想法。然而，目前關于外泌體lncRNAs在肺癌中作用的研究進展僅限于基礎研究，暫時幾乎沒有相關研究報告表明，這些研究結果已應用于臨床試驗中的新藥發現或臨床治療。因此，還需進一步的研究來闡述腫瘤中IncRNA、miRNA等相關作用機制，為對腫瘤患者提供早期、有針對性的臨床干預創造條件，同時解決患者治療期間放化療耐藥性和其他癌癥相關治療問題。