外周血microRNAs用于肺炎合并膿毒癥診斷及預后評價的價值

卞淼 逄利

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，病情危重、救治難度大、死亡率高。重癥肺炎是導致膿毒癥的常見病因，早期識別可能發展為膿毒癥的重癥肺炎患者并進行干預有助于降低膿毒癥發生率、改善預后[1-2]。炎癥反應激活是重癥肺炎及膿毒癥發生發展的病理生理基礎，微小RNA(microRNA，miR)是一類在體內分布廣泛的小分子RNA，肺內多種miRs參與炎癥反應的調控，不僅可以作為防治肺部感染及肺損傷的靶點，還能作為評價病情及預后的外周血標志物[3]。一項動物實驗通過全血miR芯片檢測技術證實，膿毒癥小鼠模型中miR-let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107、miR-451的表達發生顯著變化[4]，提示上述幾種miRs可能參與膿毒癥的發病。本研究將以此為基礎，對上述幾種miRs用于肺炎合并膿毒癥診斷及預后評價的價值展開探討。

資料與方法

一、研究對象

選擇2019年1月—2021年8月期間在我院就診的肺炎患者，納入標準：(1)符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》[5]中的診斷標準；(2)臨床資料完整；(3)入院后留取外周靜脈血；排除標準：(1)入院前接受過抗感染治療；(2)合并肺結核、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺膿腫等肺疾病；(3)合并惡性腫瘤、正在接受激素治療的患者。共納入128例肺炎患者，根據《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[6]將其分為肺炎合并膿毒癥組、不合并膿毒癥的肺炎組。另取同期在我院體檢的60例健康者作為對照組。肺炎合并膿毒癥組共45例，男25例、女性20例，年齡41～67歲、平均(58.59±9.39)歲；肺炎組共83例，男性51例、女性32例，年齡38～68歲、平均(60.03±8.57)歲；對照組中男性36例、女性24例，年齡35～65歲、平均(58.77±9.32)歲。三組間一般資料的比較無統計學差異(P>0.05)。本研究取得醫院委員會批準[臨審第(2021-216號)]。

二、研究方法

1 外周血miRs表達水平的檢測 取三組受試者的外周靜脈血3 mL。采用全血RNA提取試劑盒(北京天根公司)分離外周血RNA，采用miR cDNA第一鏈合成試劑盒合成將miR反轉錄為cDNA，采用miR熒光定量檢測試劑盒配置miR檢測的PCR反應體系，具體如下：cDNA 2μL、試劑盒內反應液10μL、10μmol/L上游引物0.4μL、試劑盒中的通用下游引物0.4μL、去離子水補足至20.0μL。將上述反應體系放入熒光定量PCR儀(Bio-rad公司)，按照下列程序進行熒光定量PCR反應：95℃ 15 min后94℃ 20s、60℃ 34s、重復40個循環。反應結束后生成循環曲線并得到循環閾值，以U6為內參，計算miR-let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107、miR-451的表達量。

2 肺炎合并膿毒癥病情嚴重程度的評估 查閱肺炎合并膿毒癥患者的病歷，采用以下指標評估病情嚴重程度：急性生理和慢性健康評分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)、白細胞計數(WBC)、中性粒細胞計數(NEU)、超敏C-反應蛋白(hs-CRP)、降鈣素原(PCT)。

3 肺炎合并膿毒癥預后的評價 根據入院后28d的生存情況評價預后，包括生存患者和死亡患者。

三、統計學處理

采用SPSS22.0軟件錄入數據，計量資料以(均數±標準差)表示，3組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，兩計量資料間的相關性采用Pearson相關分析，采用ROC曲線分析miRs用于診斷及預后評價的效能。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、三組受試者外周血miRs表達水平的比較

與對照組比較，肺炎合并膿毒癥組、肺炎組的外周血let-7d、miR-15b、miR-107、miR-451表達水平增加，miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103表達水平降低(P<0.05)；與肺炎組比較，肺炎合并膿毒癥組的外周血miR-107表達水平增加，miR-16、miR-25、miR-103表達水平降低(P<0.05)，let-7d、miR-15b、miR-92a、miR-451表達水平無統計學差異(P>0.05)(見表1)。

表1 三組受試者外周血miRs表達水平的比較

二、外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表達水平對肺炎合并膿毒癥的診斷價值

外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表達水平診斷肺炎合并膿毒癥的ROC曲線(見圖1)，經ROC曲線分析，四項指標區分單純肺炎與肺炎合并膿毒癥的效能(見表2)。

圖1 外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表達水平診斷肺炎合并膿毒癥的ROC曲線

表2 外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107表達水平診斷肺炎合并膿毒癥的ROC曲線分析

三、外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107與肺炎合并膿毒癥病情嚴重程度的相關性

外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107與肺炎合并膿毒癥病情嚴重程度相關性的Pearson檢驗如下：肺炎合并膿毒癥患者外周血miR-16、miR-25、miR-103表達水平與APACHE Ⅱ評分、WBC、NEU、hs-CRP、PCT呈負相關，miR-107表達水平與APACHE Ⅱ評分、WBC、NEU、hs-CRP、PCT呈正相關(見表3)。

表3 外周血miR-16、miR-25、miR-103、miR-107與肺炎合并膿毒癥病情嚴重程度的相關性

四、肺炎合并膿毒癥組中生存患者與死亡患者外周血miRs表達水平的比較

與肺炎合并膿毒癥組中生存患者比較，死亡患者外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103表達水平降低，miR-107表達水平增加(P<0.05)，let-7d、miR-15b、miR-451表達水平無統計學差異(P>0.05)(見表4)。

表4 肺炎合并膿毒癥組中生存患者與死亡患者外周血miRs表達水平的比較

五、外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表達水平對肺炎合并膿毒癥預后的預測價值

外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表達水平預測肺炎合并膿毒癥預后的ROC曲線(見圖2)，經ROC曲線分析，五項指標對肺炎合并膿毒癥預后的預測效能(見表5)。

表5 外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表達水平預測肺炎合并膿毒癥預后的ROC曲線分析

圖2 外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107表達水平預測肺炎合并膿毒癥預后的ROC曲線

討 論

重癥肺炎病情重，嚴重者會發展為膿毒癥，臨床救治難度大、死亡率高[7-8]。因此，深入認識普通肺炎向膿毒癥發展的病理生理機制具有迫切的臨床需求。miR是近些年分子生物學領域及表觀遺傳學領域的熱門分子，目前的研究認為炎癥反應的激活受到多種miR的調控，不同的miRs能夠在轉錄后水平調節Toll樣受體、核因子-κB、沉默信息調節因子1等基因的表達，進而起到促炎或抗炎作用。在肺炎、胰腺炎等感染性疾病的研究中，相關的動物模型中及相關的患者外周血中均存在多種miRs表達的變化[9-12]，提示miRs參與感染性疾病的發生發展且可以作為診斷疾病或評價病情的標志物。

本研究使用外周血miRs作為標志物、進行肺炎合并膿毒癥的診斷及預后評價。Hsieh CH的研究在脂多糖誘導的膿毒癥小鼠模型中通過miRs芯片檢測證實miR-let-7d、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107、miR-451的表達發生顯著變化。本研究檢測了肺炎患者及肺炎合并膿毒癥患者外周血中上述miRs表達的變化，與肺炎患者比較，肺炎合并膿毒癥組的外周血miR-107表達水平增加，miR-16、miR-25、miR-103表達水平降低，提示四種miRs可能參與肺炎合并膿毒癥的發生；進一步經ROC曲線分析證實四種miRs對區分單純肺炎與肺炎合并膿毒癥具有診斷價值，提示四種miRs可以用于肺炎合并膿毒癥的早期診斷。

國內外相關的研究結果認為miR-16、miR-25、miR-103起到抗炎作用，miR-107起到促炎作用。孫小平的研究證實，miR-16可能通過與PPARγ相關作用的方式在膿毒癥細胞模型中抑制多種炎癥細胞因子的釋放[13]；吳斌[14]和Yao Y[15]的研究在膿毒癥引起腎損害和心肌損害的模型中證實miR-25起到組織保護作用、顯著減輕炎癥反應；Yang M的研究證實miR-103靶向抑制Toll樣受體4介導的炎癥反應[16]；Wang S.的研究證實miR-107誘導腫瘤壞死因子-α的釋放并促進炎癥反應的激活[17]。本研究分析了四種miRs表達水平與肺炎合并膿毒癥病情的相關性，結果顯示：APACHE Ⅱ評分、WBC、NEU、hs-CRP、PCT等反映病情嚴重程度的指標與miR-107呈正相關，與miR-16、miR-25、miR-103呈負相關，表明在肺炎合并膿毒癥的發病過程中miR-107表達增加及miR-16、miR-25、miR-103表達降低與病情加重、炎癥反應激活有關。

最后，本研究還對肺炎合并膿毒癥患者的預后進行了評價。肺炎進展為膿毒癥后極大地增加了救治難度，臨床患者的死亡率較高。本文評價了肺炎合并膿毒癥患者的28d生存和死亡情況，45例患者中共14例死亡、死亡率31.11%；通過比較生存與死亡患者外周血 miRs的差異可知：與生存患者比較，死亡患者外周血miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103表達水平降低，miR-107表達水平增加；進一步進行ROC曲線分析可知：上述五種miRs對肺炎合并膿毒癥患者的28d生存和死亡情況具有預測價值。

綜上所述，外周血多種miRs可用于肺炎合并膿毒癥的診斷及預后評價；miR-16、miR-25、miR-103、miR-107可用于肺炎合并膿毒癥的診斷且與病情嚴重程度相關；miR-16、miR-25、miR-92a、miR-103、miR-107可用于肺炎合并膿毒癥患者預后的預測。本研究的以上結果為今后深入認識肺炎合并膿毒癥發生的病理生理機制、發現新的防治靶點及評估的分子標志物提供了臨床研究依據。