黃芪甲苷通過HMGB1/NF-κB通路減輕膿毒癥大鼠相關肺損傷

趙雅彬 李琨琨 張志偉 楊寧 運苛政 孫同文

膿毒癥是由病原微生物感染引起的全身炎癥反應綜合征，是危重癥的常見并發癥，死亡率高達30%[1]。全球每年約1900萬人罹患膿毒癥，肺臟是膿毒癥導致多臟器功能損傷中較早損傷的臟器，表現為急性肺損傷[2-3]。目前膿毒癥臨床治療所使用的抗生素類藥物，因毒副作用大且易引起藥物依賴性，亟需開發安全高效的新型藥物[4]。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ)是提取自黃芪的主要活性成分之一，具有抗炎消腫、調節免疫功能和鎮痛等作用[5]。研究發現，AS-Ⅳ能夠有效減輕膿毒癥大鼠全身炎癥反應，但其作用機制尚不明確[6]。因此，本研究旨在建立膿毒癥大鼠肺損傷模型，探討AS-Ⅳ對肺損傷的改善作用及其可能作用機制，為AS-Ⅳ藥物開發及膿毒癥臨床治療提供參考。

資料與方法

一、材料

1 實驗動物 60只SPF級雄性SD大鼠，體質量220～250 g，由浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK(浙)2019-0001。所有實驗動物在溫度20℃～24℃，相對濕度50%～60%，自然晝夜節律光照的環境中適應性飼養7 d，所有飼養設備均經過高壓、高溫滅菌，適應期間可自由獲取食物和水，墊料每日進行更換(倫理編號：2022-2xyy-008)。

2 藥品、主要試劑和儀器 AS-Ⅳ(純度≥98%，上海吉至生化科技有限公司，貨號：A70100)；腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(深圳科潤達生物工程有限公司，貨號：ELH-TNF-α)；白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA試劑盒(深圳海思安生物技術有限公司，貨號：HAS-47926，HAS-48678)；兔抗大鼠β-actin多克隆抗體、兔抗大鼠高遷移率族蛋白B1(High mobility group proteins B1, HMGB1)、核因子-κB p65(nuclear factor- κB, NF-κB p65)多克隆抗體、山羊抗兔二抗IgG(上海晶抗生物有限公司，貨號：JKR18050，JKR6202，JKR19225)。IQ5TM型熒光實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；石蠟組織切片機(RM2265，德國LEICA公司)。

二、方法

1 膿毒癥大鼠模型建立 適應性飼養7 d后，模型組、AS-Ⅳ各劑量組大鼠采用盲腸結扎穿孔法建立膿毒癥大鼠模型[7]，術前12 h禁食，自由飲水，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，固定于手術臺上，沿腹中線左側1 cm作一切口，長約1 cm，找到盲腸末端1.5 cm處，手術線結扎22號針穿刺2次，逐層縫合。對照組大鼠只開腹，不進行盲腸的結扎和穿刺。術后大鼠出現呼吸頻率明顯加快、腹瀉，精神萎靡，毛色失去光澤及抓取時全無抵抗之力等表現提示建模成功。

2 分組與給藥 60大鼠隨機分為對照組12只、模型組(12只)、AS-Ⅳ低劑量組(12只)、AS-Ⅳ中劑量組(12只)和AS-Ⅳ高劑量組(12只)。參照文獻[8-9]，AS-Ⅳ低、中、高劑量組灌胃20、40、80 mg/kg AS-Ⅳ混懸液(生理鹽水配制)，對照組及模型組于相同時間給予等量生理鹽水。各組給藥1次/d，連續7 d。

三、檢測指標

1 標本采集 末次給藥后，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，翻正反射消失后，開腹。腹主動脈采集血液，于4℃下3000 r/min高速離心機離心15 min，分離血清，-20℃保存。斷頭法處死大鼠，取出肺組織，使用預冷的生理鹽水沖洗肺組織，取部分左肺組織浸入4%多聚甲醛液固定24 h備用，其余左肺組織，-80℃保存備用。

2 肺組織濕干重比(W/D)測定 取出大鼠右肺組織后，濾紙吸取肺組織表面多余血液，天平準確稱取右肺組織質量記為濕重，再將肺組織放入80℃烤箱烘烤48 h至恒重，記為干重，計算肺組織W/D。肺組織W/D=肺組織濕重/肺組織干重。

3 炎癥因子水平檢測 取出血清和試劑盒，恢復至室溫后使用，根據TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒說明書操作。試劑盒采用雙抗體夾心法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，先用標本稀釋液1:1稀釋標本50 μL加入反應孔。其余各孔加入待測樣品，再加入50 μL生物素抗體工作液，蓋上膜板，輕輕震蕩混勻，37℃孵育30 min。甩去液體，每孔加入洗滌液，震蕩30 s，反復操作3次。再加入80 μL親和鏈霉素HRP，37℃溫育30 min，洗滌液清洗拍干，加入顯色液、終止液，使用酶標測定儀于450 nm波長處檢測各孔吸光值，計算樣品濃度。

4 肺組織HE染色觀察 取出固定后的肺組織，浸泡梯度濃度酒精溶液脫水，再使用二甲苯透明，去除透明劑后進行石蠟包埋，使用切片機切成厚度為5 μm的切片。40℃烘箱烘干，過夜。再將切片常規透明、脫水，放入蘇木精染色5 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分化10 s，自來水沖洗，再次脫水透明。使用中性樹膠，蓋片封固。觀察肺組織病理學變化。

5 肺組織病理學評分 光學顯微鏡下觀察肺組織形態變化，并采用改良版肺組織病理學評分標準[7]對各組大鼠肺組織進行評分，從大鼠肺組織肺間隔厚度、炎性細胞浸潤程度、肺泡塌陷程度評定肺組織病變程度，各部分數相加為最終得分。評分越高表明肺組織病變程度越嚴重，詳細評定標準(見表1)。

表1 肺組織病理學評定標準

6 HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達 取出備用肺組織并剪碎，加入TRIZOL液靜置裂解。按照RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA，檢測RNA濃度。反轉錄試劑盒合成cDNA，配制轉錄反應體系(20 μL)：R Nase free ddH2O 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，5×g DNA digester Mix 2 μL，4× Hifair Super Mix 5 μL，cDNA 2 μL。反應條件為95℃ 25 s，56℃ 35 s，72℃ 65 s進行40個循環。取樣本CT值平均數，以目的基因相對內參的表達量計算各樣本之間基因表達差異。引物序列設計為HMGB1-F：5′-GCATCCTGGCTTATCCATTGG-3′、HMGB1-R：5′-GGCTGCTTGTCATCTGCTG-3′；NF-κB p65-F：5′-AGAGGGGATTTCGATTCCGC-3′、NF-κB p65-R：5′-CCTGTGGGTAGGATTTCTTGTTC-3′；β-actin-F：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′、β-actin-R：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。

7 HMGB1、NF-κB p65蛋白表達 取出備用肺組織加入細胞裂解液，冰上充分研磨勻漿等待完全裂解，4℃下12000 rpm離心機離心10 min，收集上清液。使用BCA蛋白濃度試劑盒，檢測蛋白濃度。取40 μL樣品蛋白，加入配制好的分離膠與濃縮膠，恒壓80 V電泳30 min，恒壓120 V電泳至溴酚藍到達底部。260 mA電流下，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶搖床封閉2 h，再加入1:1000一抗稀釋液，4℃過夜，TBST充分清洗3次，每次10 min。加入1：3000二抗稀釋液，室溫封閉60 min，TBST清洗，滴加適量顯影液放入凝膠圖像分析儀進行顯影，保存圖像，以β-actin為內參，觀察并分析條帶上相應蛋白表達量。

四、統計學分析

結 果

一、肺組織W/D比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織W/D升高(P<0.05)。與模型組比較，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織W/D均降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠肺組織W/D降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組肺組織W/D降低(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠肺組織W/D比較

二、炎癥因子水平比較

與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05)。與模型組比，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)(見表3)。

表3 大鼠血清炎癥因子水平比較

三、肺組織HE染色比較

結果顯示，對照組大鼠肺組織結構完整，形態正常，未見炎性細胞浸潤、水腫等現象。模型組大鼠肺組織嚴重病變，肺泡間隔明顯增寬，肺泡壁明顯增厚，部分肺泡可見出血、間質水腫現象，存在大量炎性細胞浸潤現象。AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織結構受損現象得到改善，肺泡間隔減小，肺泡出血和間質水腫現象減輕，炎性細胞浸潤現象減少(見圖1)。

圖1 肺組織HE染色結果(×200，標尺=50 μm，A:對照組，B:模型組，C:AS-Ⅳ低劑量組，D:AS-Ⅳ中劑量組，E:AS-Ⅳ高劑量組)

四、肺組織病理學評分比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織病理學評分升高(P<0.05)。與模型組比較，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織病理學評分均降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠肺組織病理學評分降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組肺組織病理學評分降低(P<0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠肺組織病理學評分比較 分)

五、HMGB1、NF-κB p65 mRNA水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達水平升高(P<0.05)。與模型組比，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比較，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠肺組織HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組大鼠肺組織HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達水平降低(P<0.05)(見表5)。

表5 大鼠HMGB1、NF-κB p65 mRNA水平比較

六、HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平升高(P<0.05)。與模型組比，AS-Ⅳ低、中、高劑量組大鼠肺組織HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ低劑量組比較，AS-Ⅳ中、高劑量組大鼠肺組織HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平降低(P<0.05)。與AS-Ⅳ中劑量組比，AS-Ⅳ高劑量組大鼠肺組織HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平降低(P<0.05)(見表6，圖2)。

表6 大鼠HMGB1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平比較

圖2 肺組織蛋白檢測

討 論

膿毒癥患者由于體內感染的病原體毒素持續釋放，機體的免疫系統受到過度激活，炎性因子高度表達，導致細胞、組織器官和免疫系統均會受到不可逆的損傷[8]。多達70%的膿毒癥患者會出現嚴重的肺損傷，表現出呼吸困難等表癥[9]。針對膿毒癥肺損傷的治療集中在控制感染源、液體治療、血管活性藥物的應用和調節免疫系統。近年來研究發現，一些針對炎癥信號通路的靶向藥物在膿毒癥的治療中取得良好效用[10]。

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是一種傳統的補氣中草藥，其主要成分包括AS-Ⅳ、黃芪苷、異黃芪苷、三萜皂苷、黃酮及多糖等[11]。AS-Ⅳ作為黃芪的標志成分之一，因其抗炎、活血化瘀的藥效臨床常用于炎癥介質的靶向治療[12]。本研究采用盲腸結扎穿孔法建立膿毒癥大鼠模型，從分子機制上探討AS-Ⅳ對膿毒癥大鼠肺臟損傷的修復作用。結果顯示，模型組大鼠肺組織W/D比值、肺組織病理學評分、TNF-α、IL-1β、IL-6均升高，表明膿毒癥模型建立成功且模型組大鼠肺組織受到嚴重損傷，大鼠體內伴有嚴重的炎癥反應。給予不同劑量的AS-Ⅳ治療后大鼠均表現肺組織W/D比值、肺組織病理學評分、TNF-α、IL-1β、IL-6降低，提示大鼠肺組織損傷得到修復，體內的炎癥反應也明顯減輕。此外，大鼠肺組織HE染色結果也表明肺泡間隔縮小，肺泡出血和間質水腫現象減輕，細胞腫脹、炎性細胞浸潤現象減少。以上結果均證實AS-Ⅳ對膿毒癥大鼠肺組織損傷具有修復作用。

在本研究中，與模型組比較，AS-Ⅳ各劑量組大鼠肺組織HMGB1和NF-κB p65 mRNA水平降低，且HMGB1和p-NF-κB p65蛋白表達水平也呈現降低趨勢。HMGB1作為下游炎癥重要參與因子，在膿毒癥的發生、發展中均起到關鍵作用[13]。在細胞內，HMGB1參與核小體內DNA復制、修復，細胞分化等多種生理過程；釋放至細胞外時，HMGB1可介導炎癥反應、促進腫瘤生長等，參與更廣泛的生物學行為[14]。炎癥反應是膿毒癥引起臟器損傷的重要機制之一，在膿毒癥病程發展中，外周的炎性因子集中在組織已受到破壞的臟器，激活HMGB1/NF-κB通路釋放更多的促炎因子從而進一步加強炎癥反應，加劇臟器損傷[15]。HMGB1分泌到細胞外發揮促炎作用時，通過與受體結合，激活下游NF-κB信號通路，在膿毒癥發展過程中，活化的NF-κB通路能夠釋放大量TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，促進炎癥級聯反應[16]。結合血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平變化，可見AS-Ⅳ能夠抑制HMGB1/NF-κB通路，減少NF-κB p65磷酸化，減輕炎癥反應，對大鼠肺組織損傷有積極影響。

綜上所述，AS-Ⅳ能夠改善膿毒癥大鼠肺組織損傷，減輕炎癥反應，可能是通過抑制HMGB1/NF-κB通路，減少NF-κB p65磷酸化蛋白表達發揮作用，為臨床治療膿毒癥提供實驗依據。