楊寧梅 陽元彬 杜鳳 羅鳳華

慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)是慢性阻塞性肺疾病患者住院和死亡的最常見原因[1]。由于長期氣流受阻，肺過度充氣，可導致膈肌變形和功能進行性減退[2-3]。線粒體是骨骼肌活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的主要來源，ROS過度產生可破壞蛋白質、脂質和 DNA，導致膈肌萎縮和功能障礙[4]，線粒體功能障礙可引起膿毒癥所致膈肌功能障礙使患者呼吸衰竭以及機械通氣脫機困難[5]。氧化應激和全身炎癥反應刺激下線粒體出現自噬異常，并與慢性阻塞性肺疾病骨骼肌功能障礙有關[6]，慢性阻塞性肺疾病合并外周骨骼肌功能障礙患者線粒體呼吸速率、呼吸控制率、線粒體DNA表達顯著降低[7]。本研究擬檢測AECOPD患者外周血單個核細胞線粒體功能，探討其與膈肌功能障礙的關系，以期臨床診治提供參考。

資料與方法

一、臨床資料

選擇2020年1月至2021年8月我院收治的115例AECOPD患者，納入標準：①符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)診治中國專家共識(2017年更新版)》相關診斷流程和標準[8]；②年齡18周歲以上；③均接受超聲檢查，評估膈肌功能，臨床資料完整。排除標準：①急性肺水腫、肺氣腫、胸腔積液；②膈肌麻痹病史、外傷所致膈肌破裂，膈肌手術史；③肺間質疾病；④先天性胸廓畸形；⑤格林巴利綜合征；⑥肺結核、肺癌、肺源性心臟病；⑦血液系統或免疫系統疾病。膈肌功能障礙診斷標準[9]：①用力肺活量(FVC)<預計值的50%，仰臥位時下降超過30%；最大吸氣壓(MIP)<預計值的40%；②跨膈壓(Pdi)<40 cmH2O，膈神經刺激誘導Pdi<28 cmH2O,膈肌張力緊張指數(TTdi)>1.5；③超聲提示膈肌厚度(功能殘氣位)<1.5～2 mm，膈肌厚度變異率<30%～36%，膈肌移動度<10～14 mm。符合②或①、③中任何一項可診斷。115例患者中41例發生膈肌功能障礙(障礙組)，74例未發生膈肌功能障礙(無障礙組)，兩組性別、年齡、吸煙史、病程比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)，本研究已經獲得我院倫理委員會批準(190518)。

表1 基線資料

二、線粒體功能檢測方法

入院24h內采集空腹外周靜脈血5 mL注入肝素抗凝試管，等量磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋血液，Ficoll-Paque (德國默克Sigma-Aldrich)密度梯度上分層，室溫下 800×g離心30 min，采用移液器從 Ficoll-Paque 和血漿間界面提取單核細胞，PBS洗滌兩次，800×g離心10 min，低滲氯化鈉(0.2%)、高滲氯化鈉(1.6%)分別重懸單核細胞1 min，PBS 洗滌離心。線粒體裂解液提取單個核細胞線粒體，Bradford 法測定線粒體蛋白濃度，線粒體濃度保持在2～3mg/mL線粒體。氧電極法測量狀態Ⅲ(ST3)、狀態Ⅳ(ST4)單位時間內每毫克線粒體蛋白消耗氧的量[( nmoL·O2) /( min·mg· protein)]，計算呼吸控制率(RCR)=ST3/ST4×100%。雙波長分光光度法測定在516、495 nm波長下線粒體跨膜電位吸光度值，跨膜電位采用熒光探針羅丹明123(Rh123)標記指示劑標記，計算516、495 nm波長下吸光度值的差值為膜電位吸光度差，吸光度增加表示線粒體跨膜電位下降[10]。采用葡萄糖/己糖激酶系統測定單位時間內無機磷消耗的量，即三磷酸腺苷酶(ATP)生成水平，以nmoL/mg·min表示。

三、膈肌功能評估

1 肺功能檢查 入院24h內采用FGC -A肺功能測試儀(安徽電子科學研究所)檢測肺通氣功能，患者坐位，鼻夾夾住鼻腔防止漏氣，囑患者深吸氣后咬住吹嘴以最大力度最快速度吹氣，儀器自動測量記錄第1秒用力呼氣容積(FEV1)，FVC，囑患者呼氣后快速用力深吸氣，測量MIP。以上均重復測量3次，取3次測量的平均值。

2 呼吸力學檢測 入院24 h內采用患者坐位，經鼻置入2條頂端帶氣囊(10 cm×3.5 cm)的導管，1條置于胃內，1條置于食道，置入后氣囊充氣(胃囊0.8 mL～1 mL，食道囊0.4 mL～0.6 mL)，導管外端連接壓力傳感器。囑患者先平靜呼吸，當處于功能殘氣量時，夾緊鼻腔，緊閉聲門，以最大力度吸氣并做鼓腹動作，測得平靜呼吸時兩個導管壓力差值為Pdi，功能殘氣量時兩個導管壓力差值為最大跨膈壓(Pdimax)，刺激器刺激膈神經誘發膈肌顫搐，測定膈神經刺激誘導Pdi和Pdimax，并記錄吸氣時間(Ti)與呼吸周期總時間(Ttot)，計算TTdi=(Pdi/ Pdimax)×(Ti/Ttot)[11-12]。以上均重復測量3次，取3次測量的平均值。

3 胸部B超檢查 入院24 h內采用進行超聲檢查，飛利浦EPIQ7C超聲診斷儀，患者平臥，正常呼吸，線陣探頭(頻率2.5～5MHz)置于第8～10肋間和右側腋前線之間，觀察呼吸狀態1 min，凍結吸氣末、呼氣末、功能殘氣量清晰圖像，測量平靜吸氣末、呼氣末、功能殘氣量時膈肌厚度，計算膈肌厚度變異率=[(吸氣末膈肌厚度-呼氣末膈肌厚度)/呼氣末膈肌厚度×100%]。更換心臟探頭(頻率3.0～5MHz)，置于腋下和肋弓下緣交界處，取肝臟聲窗，顯示膈肌運動圖像，測量吸氣末、呼氣末膈肌運動幅度，計算膈肌移動度(吸氣末膈肌運動幅度-呼氣末膈肌運動幅度)。以上均重復測量3次，取3次測量的平均值[13]。

四、統計學分析

結 果

一、兩組外周血單個核細胞線粒體功能評估結果比較

障礙組RCR、ATP低于無障礙組(P<0.05)，膜電位吸光度差高于無障礙組(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組外周血單個核細胞線粒體功能評估結果差異

二、兩組膈肌功能評估結果比較

障礙組FEV1、FVC、MIP、Pdi、Pdimax、膈神經刺激誘導Pdi、膈神經刺激誘導Pdimax、功能殘氣位膈肌厚度、膈肌厚度變異率、膈肌移動度均低于無障礙組(P<0.05)，TTdi大于無障礙組(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組膈肌功能評估結果差異

三、AECOPD患者外周血單個核細胞線粒體功能與膈肌功能指標的相關性分析

AECOPD患者RCR、ATP與FEV1、FVC、MIP、Pdi、Pdimax、膈神經刺激誘導Pdi、膈神經刺激誘導Pdimax、功能殘氣位膈肌厚度、膈肌厚度變異率、膈肌移動度呈正相關(P<0.05)，與TTdi呈負相關(P<0.05)；膜電位吸光度差與FEV1、FVC、MIP、Pdi、Pdimax、膈神經刺激誘導Pdi、膈神經刺激誘導Pdimax、功能殘氣位膈肌厚度、膈肌厚度變異率、膈肌移動度呈負相關(P<0.05)，與TTdi呈正相關(P<0.05)(見表4)。

表4 AECOPD患者外周血單個核細胞線粒體功能與膈肌功能指標的相關性

四、外周血單個核細胞線粒體功能診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的價值分析

RCR、膜電位吸光度差、ATP診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的截斷值為1.80%、13.02、86.23 nmoL/mg·min，曲線下面積為0.734、0.665、0.705，低于Pdimax、TTdi(Z=2.433、5.475；2.901、5.965；2.317、5.390，P=0.015、<0.001；0.004、<0.001；0.021、<0.001)，與Pdi接近(Z=0.955、0.661、0.307，P=0.340、0.509、0.759)，聯合RCR、ATP、膜電位吸光度差診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的曲線下面積為0.898，高于Pdimax(Z=2.125，P=0.034)，略低于TTdi(Z=2.818，P=0.005)(見表5、圖1)。

表5 外周血單個核細胞線粒體功能診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的效能

圖1 外周血單個核細胞線粒體功能診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的ROC圖

討 論

呼吸困難是AECOPD的主要臨床表現，呼吸肌收縮功能下降是導致呼吸困難的主要原因之一。膈肌是人體最主要的呼吸肌，在正常平靜狀態下膈肌收縮產生的吸氣量占總潮氣量的80%，在AECOPD發展過程中，受長期氣道阻力增加、通氣需求增多、全身炎癥反應、長期使用類固醇、呼氣末正壓和過度充氣相關機械損傷等因素的影響，膈肌結構和收縮功能發生改變[14]。現有研究顯示慢性阻塞性肺疾病患者往往合并不同程度的膈肌功能障礙，膈肌功能障礙肺通氣功能下降，呼吸困難加重，低氧血癥、二氧化碳潴留，日常活動能力和生活質量下降，并增加因頻繁急性加重而住院的風險[15]。膈肌功能障礙發病機制復雜，涉及肌纖維蛋白合成代謝受損、肌纖維蛋白降解增強、彌漫性炎癥和氧化應激增加、代謝激素失衡、肌核細胞凋亡、自噬和肌纖維重塑等多個環節[16]，線粒體氧化應激在膈肌功能障礙中發揮關鍵作用。

本研究發現障礙組RCR、ATP低于無障礙組，膜電位吸光度差高于無障礙組，表明AECOPD膈肌功能障礙患者存在外周血單個核細胞線粒體功能異常，線粒體功能變化可能是AECOPD膈肌功能障的潛在機制。線粒體是細胞能量產生的主要場所，在產生ATP的同時可產生ROS，并可調節鈣反應，介導細胞增殖、分化和凋亡，線粒體功能異常與阿爾茨海默病、創傷性腦損傷、癲癇、癌癥等許多疾病發病有關[17]。線粒體在骨骼肌代謝和收縮活動中發揮關鍵作用，線粒體為骨骼肌收縮提供能量來源，線粒體功能障礙會導致骨骼肌無力和疲勞，降低抗氧化能力，引起ROS生成增加，激活炎癥反應，導致骨骼肌蛋白水解增加和肌肉萎縮[18]。線粒體還可調節膈肌膜蛋白的合成和降解，線粒體功能失調可引起ROS大量產生，導致強烈氧化應激，誘導蛋白質氧化和功能改變， 增強細胞自噬和凋亡，與危重病患者膈肌功能障礙的發生有關[19]。本研究進一步分析發現AECOPD膈肌功能障礙患者RCR、ATP與FEV1、FVC、MIP、Pdi、Pdimax、膈神經刺激誘導Pdi、膈神經刺激誘導Pdimax、功能殘氣位膈肌厚度、膈肌厚度變異率、膈肌移動度呈正相關，與TTdi呈負相關，膜電位吸光度差則相反，表明線粒體功能下降與AECOPD患者肺通氣功能下降，膈肌疲勞，膈肌厚度減少、收縮力減弱和運動力降低有關。檢測外周血單個核細胞線粒體功能可反映AECOPD患者膈肌功能，為臨床提供更為簡便、可重復性強的客觀生物學指標。

Pdi被認為是評估膈肌收縮強度的金指標，但是需受試者配合平靜呼吸和用力呼吸，在一定程度上受主觀因素影響較大，綜合膈神經刺激可提高診斷膈肌功能障礙的準確性。TTdi綜合膈肌收縮強度和持續時間指標，能反映膈肌耐力，與膈肌收縮力比較，膈肌耐力更能反映膈肌疲勞度[20-21]。本研究ROC分析結果顯示RCR、ATP、膜電位吸光度差診斷AECOPD膈肌功能障礙具有一定價值，聯合三項指標后診斷效能明顯提高，略低于TTdi，與Pdi接近，說明綜合檢測外周血線粒體功能可較好的判斷AECOPD患者膈肌功能障礙的發生，對臨床預防和治療提供參考。

線粒體功能失調引起AECOPD患者膈肌功能障礙的機制尚不明確，分析可能的原因有：首先，線粒體氧化應激激活了內源性凋亡、蛋白酶體、自噬等蛋白質降解信號通路，導致膈肌蛋白質降解增強, 誘發膈肌功能障礙[22]。其次，線粒體功能失調導致線粒體氧化磷酸化顯著降低，糖酵解增加，導致肌肉整體能量供應減少[23]。第三，線粒體調節肌肉中神經遞質酶的活性，線粒體功能障礙可導致膈肌乙酰膽堿酯酶活性降低，引起膈肌功能障礙[24]。

綜上，AECOPD合并膈肌功能障礙患者外周血單核細胞線粒體RCR、ATP降低，膜電位吸光度差增高，線粒體功能失調與AECOPD患者肺通氣功能下降，膈肌疲勞，膈肌厚度減少、收縮力減弱和運動力降低有關，可作為AECOPD患者膈肌功能障礙診斷的潛在指標。本研究樣本量偏少，不能代表所有AECOPD合并膈肌功能障礙患者，且為單中心研究，尚需進一步擴大樣本例數，開展多中心研究加以證實。