碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌基因型檢測研究

萬會林 曹小利 王小梅 韓亞飛 孔燕 趙丹妹 諸君

肺炎克雷伯菌是一種革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于哺乳動物鼻咽和胃腸道中，是導致醫院感染發生的主要病原菌之一[1]。碳青霉烯類抗菌藥物是臨床抗感染常用藥物，包括亞胺培南、美羅培南、多尼培南等，其抗菌活性較強、抗菌譜較廣，且毒性較低，在治療革蘭氏陰性桿菌中具有重要應用價值[2]。然而由于碳青霉烯類抗菌藥物的濫用及不合理使用，導致病原菌對該類藥物的耐藥性不斷增強，并導致碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)形成[3]。我國多項調查報道[4-5]，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性及CRKP檢出率呈逐年上升趨勢，CRKP感染治療已成為當前臨床感染防控工作面臨的嚴峻考驗。本研究檢測分析CRKP基因類型并對患者臨床特征進行分析，以期為臨床防控及治療CRKP提供參考。

資料與方法

一、臨床資料

回顧性分析我院2018年9月～2021年8月收治的56例分離出CRKP菌株患者的臨床資料。納入標準：(1)根據病原學檢測確診，經血培養或痰培養，攜帶細菌鑒定結果為CRKP陽性；(2)臨床資料完整；(3)年齡≥18歲。排除標準：(1)同一患者重復菌株；(2)可疑污染挑取血液或痰液可疑部位(膿、 黏液)涂片，革蘭染色后進行顯微鏡檢查， 根據平均每個低倍視野下出現鱗狀上皮細胞(Squamous epithelial cells，SEC)和白細胞(white blood cell，WBC)的多少或比例，判斷送檢標本污染程度，不合格標準[6]：SEC≥10個或WBC≤25個；SEC/WBC≥1.25；SEC>0，WBC=0。本次研究符合《赫爾辛基宣言》相關要求。本次研究通過醫院倫理委員會審核，符合審核標準，倫理同意號：(同)2021-019-01。

二、方法

1 CRKP耐藥基因檢測 使用PCR擴增和DNA測序檢測CRKP耐藥基因(包括KPC、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48)，引物參考相關文獻[7-8]設計，并由TaKaRa生物技術公司合成，引物序列(見表1)。

表1 CRKP耐藥基因引物序列

2 細菌鑒定及耐藥性分析 使用全自動微生物分析系統(Vitek 2 Compact 30，法國生物梅里埃)進行病原菌鑒定及耐藥性分析，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

三、觀察指標

記錄患者年齡、性別、收治科室、標本來源、合并基礎疾病情況、抗菌藥物使用情況、住院時間以及侵入性操作情況等資料。

四、統計學方法

結 果

一、CRKP基因型分析

經檢測及BLAST比對，56株CRKP中檢出47株KPC型耐藥基因(83.93%)、9株NDM-1型耐藥基因(16.07%)，未檢出IMP、VIM以及OXA-48耐藥基因(見表2)。

表2 56例CRKP基因型分析

二、不同基因型CRKP耐藥性分析

耐藥性分析結果發現，KPC和NMD-1型耐藥基因對氨曲南耐藥性差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 不同基因型CRKP耐藥性分析

三、不同基因型CRKP患者臨床特征分析

KPC和NMD-1型耐藥基因對應患者年齡、性別、收治科室、標本來源分布情況、合并基礎疾病、抗菌藥物使用時間、3種及以上抗菌藥物聯用史、住院時間以及侵入性操作比較差異均無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

表4 不同基因型CRKP患者臨床特征分析

討 論

碳青霉烯類抗菌藥物是臨床治療革蘭氏腸桿菌屬細菌感染的常用藥物，然而由于該類藥物頻繁及不合理使用使病原菌耐藥性不斷增強，最終導致耐碳青霉烯腸桿菌形成，給感染防控、醫療工作帶來了極大的挑戰[9-10]。CRKP是耐碳青霉烯腸桿菌中最常見的一類細菌，同時也是臨床感染中最重要的病原菌之一，其在全球范圍內廣泛傳播，CRKP已成為當前臨床上亟待解決的醫學難題[11-12]。

本文研究結果表明，56株CRKP檢出47株KPC型耐藥基因和9株NDM-1型耐藥基因，其檢出率分別為83.93%和16.07%，提示CRKP基因型主要以KPC型為主。黃秋艷等[13]研究報道，CRKP常見類型為KPC，少見NDM-1和VIM，陳婭等[14]研究也表明，分離CRKP均檢出KPC型耐藥基因，均與本文研究結果相符。值得注意的是，CRKP耐藥機制較為復雜，而其中產碳青霉烯酶是CRKP耐藥主要原因[15-16]。碳青霉烯酶主要包括A、B、D三類，A類主要水解頭霉素類以外幾乎所有的β-內酰胺類抗菌藥物，其主要包括KPC、SME、GES等，B類包括NDM-1、IMP、VIM等，相比于A類酶檢出相對較少，其對青霉素類、頭孢菌素類以及碳青霉烯類藥物耐藥性較強，對單環β-內酰胺類抗菌藥物較敏感，D類主要包括OXA-48，在我國檢出率較低，其主要對苯唑西林有較強耐藥性[17]。本文研究結果表明，KPC型和NDM-1型耐藥基因對氨曲南耐藥性有明顯差異，氨曲南是臨床中常用的一種單環β-內酰胺類抗菌藥物，結合前文研究表明耐藥性差異與基因型類型不同有關，CRKP不同基因型對于不同抗菌藥物存在異質性，臨床治療CRKP患者可結合基因檢測結果合理使用抗菌藥物，值得注意的是，本研究中KPC和NDM-1對其他常用抗菌藥物的耐藥性也有所差異，但由于樣本量較少，兩者未見顯著差異，后續還需收集更多樣本進一步分析驗證。

本研究進一步分析患者臨床特征，結果表明，56株CRKP收治科室分別為重癥監護室、腫瘤科、神經內/外科、康復科、消化內科、腎內科、泌尿外科、呼吸科、感染科、內分泌科、普外科，其中CRKP分離的臨床科室在重癥監護室占比最高，占28.57%(16/56)，與相關研究報道相符[18]。重癥監護室患者通常病情較嚴重，免疫功能較弱，病房環境相對復雜，且常常需要接受氣管插管、機械通氣、中心靜脈置管等侵入性操作，相比于其他科室患者更加容易發生感染，因此結合本文研究結果提示CRKP感染防控治療工作需重點關注重癥監護室患者情況[19]。分析CRKP菌株標本來源發現，56株CRKP菌株分別來源于痰樣、尿液、血液、膿液以及其他(膽汁、引流液等)，其中CRKP菌株來自痰樣標本最多，占42.86%(24/56)，其次為尿液，占26.79%(15/56)，張侃等報道[20]，CRKP分離菌株主要來源于呼吸道和泌尿道，與本文研究結果相符。既往相關研究也報道[21]，呼吸道和泌尿道是人體與外界相通的腔道，是感染發生最常見的場所，結合本文研究結果提示，CRKP感染防控需加強患者呼吸道管理和基礎衛生護理工作，以盡量避免患者發生呼吸道及尿路感染。但值得注意的是，本研究結果表明，兩組患者的年齡、性別、收治科室、標本來源分布情況、合并基礎疾病、抗菌藥物使用時間、3種及以上抗菌藥物聯用史、住院時間以及侵入性操作等臨床特征比較差異均無統計學意義，與既往相關研究[22-23]結論有所不同，分析其原因可能與本研究采集樣本量較少所致，增加樣本量兩組患者各指標差異是否顯著化仍有待進一步研究。

綜上所述，CRKP基因型主要以KPC型最常見，占83.93%，不同基因型CRKP對常用抗菌藥物耐藥性存在異質性，臨床抗感染治療需結合基因檢測及耐藥性分析制定合理方案，此外，不同基因型CRKP臨床特征無明顯差異，但由于樣本量較少，統計分析結果可能存在片面性，研究結果可信度不高，此外，由于本研究樣本均取自同一中心病例，研究結論具有一定局限性，因此還需收集更多中心的樣本進行多中心研究以完善本文研究。