3種醫(yī)院制劑的微生物限度方法驗(yàn)證

王一帆,夏 偉，賀 娟，李 春，陳 婷**

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，云南 昆明 650000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院 藥劑科，云南 昆明 650000；3.貴州醫(yī)科大學(xué)神奇民族醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)系，貴州 貴陽 550000)

10%魚肝油軟膏、復(fù)方薄荷腦滴鼻劑和10%氯化鉀溶液均收載于《解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》(2015年版)。10%魚肝油軟膏主要功效是營養(yǎng)、潤滑、保護(hù)和有助于肉芽組織生長，能促進(jìn)燙傷、潰瘍的傷口愈合，臨床上用于改善慢性皮膚結(jié)核、外傷、燒燙傷、皸裂、魚鱗病、潰瘍及皮膚干燥等。復(fù)方薄荷腦滴鼻劑具有潤濕和保護(hù)鼻腔黏膜、促進(jìn)黏膜血液循環(huán)、刺激鼻腔黏膜細(xì)胞的再生功能的作用，臨床上用于治療干燥性鼻炎、萎縮性鼻炎、慢性鼻竇炎及過敏性鼻炎誘發(fā)的鼻腔黏膜糜爛。10%氯化鉀溶液主要治療低鉀血癥及洋地黃中毒引起的心率失常。

醫(yī)院制劑是根據(jù)醫(yī)院臨床需要，由本單位配置的固定處方制劑，具有配置量少、使用周期短、能滿足臨床治療需要、提高醫(yī)院效益、推進(jìn)合理化用藥等優(yōu)勢。醫(yī)院制劑要確保其質(zhì)量穩(wěn)定，其中的微生物限度檢查就是制劑安全性檢查的重要指標(biāo)[1-2]。

為了確保建立的微生物方法適用于這3種醫(yī)院制劑，現(xiàn)按照 2020 年版《中華人民共和國藥典》第四部的要求，建立了10%魚肝油軟膏，復(fù)方薄荷腦滴鼻劑和10%氯化鉀溶液的微生物計(jì)數(shù)法和控制菌檢查法，并進(jìn)行了方法適用性驗(yàn)證[3-5]。

1 微生物限度方法建立

1.1 儀器

潔凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；MSL.N蒸汽滅菌器(威海威高海盛醫(yī)用設(shè)備有限公司)；ME55/02型分析天平(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司，精度為十萬分之一)

1.2 試藥

10%魚肝油軟膏(批號為201105、201230、210201，規(guī)格均為 20 g/盒)，復(fù)方薄荷腦滴鼻劑(批號210706、210915、211116)，10%氯化鉀溶液(批號210518、210804、211018)，均由解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院所提供。

1.3 培養(yǎng)基

pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(Lot：317N031)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Lot：108675)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(Lot:1090411)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(Lot:1082136)、溴化十六烷基三甲基銨瓊脂培養(yǎng)基(Lot：1081174)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Lot:1090021)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(Lot:108T031)、麥康凱液體培養(yǎng)基(Lot:317E031)，生產(chǎn)廠家均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 菌種

①白色念珠菌[CMCC(F)98001]；②枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]；③黑曲霉[CMCC(F)98003]；④銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]；⑤金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；⑥大腸埃希菌[CMCC(B)44102]。均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.5 方法

1.5.1 溶液制備

1)菌液制備

按2020版《中華人民共和國藥典(四部)》通則1105項(xiàng)下方法制備菌液[6]。

2)供試液制備

10%氯化鉀溶液供試品的制備：取10%氯化鉀溶液 10 mL，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中(不超過 40 ℃)100 mL，混勻，制成 1∶10(體積比)的供試液；

10%魚肝油軟膏供試品的制備：取10%魚肝油軟膏 10 g，加入 20 mL 無菌十四烷基異丙酯和無菌玻璃珠的三角瓶中，振搖，混勻。再加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(45 ℃)100 mL，振搖，混勻，然后倒入分液漏斗中，靜置一段時(shí)間，待油水分層后，取水層作為1∶10的供試液[7]。

復(fù)方薄荷腦滴鼻液供試品的制備：取復(fù)方薄荷腦滴鼻液 10 mL，加入 10 mL 無菌十四烷基異丙酯溶液和無菌玻璃珠到三角瓶中,振搖，混勻。再加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(45 ℃)100 mL，振搖，混勻，然后倒入分液漏斗中，靜置一段時(shí)間，待油水分層后，取水層作為1∶10的供試液。

1.5.2 細(xì)菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

試驗(yàn)組：取1.5.1中2)項(xiàng)下的供試液 9.9 mL，每批5份，每份加入銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌及黑曲霉菌的菌液 0.1 mL,使供試液每 1 mL 含菌量不大于 100 CFU。混勻，吸取各染菌供試液 1 mL，分別注入平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每份平行制備2個(gè)平板，待凝固后，35 ℃ 培養(yǎng) 3 d，測定需氧菌總數(shù)；取1.5.1中2)項(xiàng)下的供試液 9.9 mL，每批2份，每份加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌液 0.1 mL，使供試液每 1 mL 含菌量不大于 100 CFU。混勻，吸取各染菌供試液 1 mL 注入平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每份平行制備2個(gè)平板，待凝固后，25 ℃ 培養(yǎng) 5 d，測定霉菌及酵母菌總數(shù)[8-15]。

陽性對照組：用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，同試驗(yàn)組操作。

供試品組：用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗(yàn)組操作。

稀釋劑組：用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液、菌液，同試驗(yàn)組操作。

驗(yàn)證試驗(yàn)分3次獨(dú)立完成，各試驗(yàn)組分別采用上述方法平行做3次。

計(jì)算: 細(xì)菌、霉菌和酵母菌總數(shù)的回收率

計(jì)算公式：回收比值=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品組平均菌落數(shù))/陽性對照組的平均菌落數(shù)。

1.5.3 控制菌檢查方法適用性

根據(jù)2020版藥典四部通則1107規(guī)定，皮膚給藥制劑的控制菌為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，鼻用制劑的控制菌為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌，口服制劑控制菌為大腸埃希菌[6-15]。

1)金黃色葡萄糖球菌

試驗(yàn)菌組：取1.5.1中2)項(xiàng)下的1∶10的供試液 10 mL 兩份，分別加入含菌量不大于 100 CFU 的金黃色葡萄球菌菌液及含菌量不大于 100 CFU 大腸埃希菌菌液，混勻。加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 100 mL 中，35 ℃ 培養(yǎng) 24 h。

陽性對照組：用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，同試驗(yàn)組操作。

供試品組：用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗(yàn)組操作。

陰性對照組：用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液、菌液，同試驗(yàn)組操作。

選擇與分離培養(yǎng)：取上述試驗(yàn)中的液體培養(yǎng)基，接種到甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，再在 35 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng) 24 h。

結(jié)果判斷：在平板上，如果沒有金黃色葡萄糖球菌菌落的特征，則判定為未檢出，且大腸埃希菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上不生長。

2)銅綠假單胞菌

用銅綠假單胞菌替代1.5.3中1)項(xiàng)中的金黃色葡萄球菌，分組和操作同1.5.3中1)項(xiàng)金黃色葡萄糖球菌的操作。

選擇與分離培養(yǎng)：取上述試驗(yàn)中的液體培養(yǎng)基，劃線到溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，再在 35 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng) 24 h。

氧化酶試驗(yàn)：將無菌的濾紙片放在平皿上，用玻璃棒在上述平板蘸取生長的菌落涂于濾紙片上，隨后滴加2滴的新配制的1%二鹽酸N,N-二甲基對苯二胺試液，若在 30 s 內(nèi)培養(yǎng)物變成粉紅色并且逐漸變紫紅色，則可以判定為氧化酶試驗(yàn)陽性，反之則為陰性[16]。

結(jié)果判斷：如果未出現(xiàn)銅綠假單胞菌的特征，則判定為未檢出，且大腸埃希菌在溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上不生長。

3)大腸埃希菌

試驗(yàn)菌株組：取1.5.1中2)項(xiàng)下的1∶10的供試液 10 mL 兩份，分別加入含菌量不大于 100 CFU 的大腸埃希菌的菌液及含菌量不大于 100 CFU 金黃色葡萄球菌的菌液，混勻。加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 100 mL 中，35 ℃ 培養(yǎng) 24 h。

選擇與分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物 1 mL 接種至 100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44 ℃ 培養(yǎng) 24～48 h。金黃色葡萄球菌接種到麥康凱液體培養(yǎng)基上，不生長。取麥康凱液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃ 培養(yǎng)18～72 h。

結(jié)果判斷：如果未出現(xiàn)大腸埃希菌的特征，則判定為未檢出，且金黃色葡萄球菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上不生長。

1.5.4 細(xì)菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌、霉菌和酵母菌的回收率均在0.5～2.0之間，同時(shí)稀釋劑組無菌生長，說明方法可行(見表1、表2)。

表1 需氧菌總驗(yàn)證回收比值

表2 霉菌和酵母菌驗(yàn)證回收比值

1.5.5 控制菌檢查方法適用性結(jié)果

在控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)中，試驗(yàn)組能夠檢出所加試驗(yàn)菌相應(yīng)反應(yīng)特征，同時(shí)陰性對照均無菌生長，說明方法可行(見表3)。

表3 控制菌檢查結(jié)果

2 討論

藥品檢驗(yàn)是保障藥品質(zhì)量和安全性的重要關(guān)卡，微生物檢驗(yàn)又是其中一項(xiàng)重要措施。本研究建立了10%魚肝油軟膏、復(fù)方薄荷腦滴鼻劑和10%氯化鉀溶液的微生物限度檢查方法。針對不同制劑類型采用不同的試驗(yàn)方法，能精準(zhǔn)消除一些干擾因素，使操作簡捷，結(jié)果精確，提高了醫(yī)院制劑的檢測質(zhì)量，也為相似制劑的微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)提供了參考。

微生物污染，會(huì)造成制劑的變質(zhì)、失效，甚至?xí)a(chǎn)生毒性。而污染原因可能有以下幾種情況：①原料藥:一般購入的原料藥都是符合規(guī)定的，但不能排除在運(yùn)輸、儲存時(shí)污染；②操作環(huán)境及操作人員的衛(wèi)生情況；③容器及包材。通過微生物限度檢查，嚴(yán)格控制院內(nèi)制劑的質(zhì)量安全，加強(qiáng)醫(yī)院制劑生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)的管控，從根源上避免污染的情況，確保醫(yī)院制劑的療效和用藥安全。

3 結(jié)語

本試驗(yàn)中測需氧菌、霉菌及酵母菌總數(shù)的驗(yàn)證時(shí)采用1∶10的供試液加菌回收比值均落在0.5～2.0的范圍內(nèi)，測控制菌的檢測方法驗(yàn)證時(shí)，試驗(yàn)組和菌液組對應(yīng)菌株生長良好，陰性對照組、供試品組和試驗(yàn)菌株組無菌生長，故這3種醫(yī)院制劑都采用常規(guī)法進(jìn)行檢驗(yàn)。2020版《中華人民共和國藥典》對的油脂類供試品的處理方法是取供試品，添加滅菌的十四烷酸異丙酯。十四烷基異丙酯滿足藥典要求，能溶解分散疏水性的制劑，且本身沒有抑菌活性，還能消除制劑中的一些抑菌成分。這種化學(xué)助溶方法，較水浴加熱助溶法更易操作，步驟簡單。所以在本試驗(yàn)中，10%魚肝油軟膏和復(fù)方薄荷腦滴鼻劑的供試品處理中，都加入了十四烷酸異丙酯。前處理中，還用到了無菌玻璃珠讓溶液混合得更加均勻，加上分液漏斗的萃取，使供試品提取得更加完全。這些創(chuàng)新的處理方法為供試品處理方法提供了新思路，找尋高效簡便及符合藥典規(guī)定的試驗(yàn)方法是很有必要的。