正交試驗法優選水藥八角蓮的姜制工藝*

孫曉惠，陸錦銳，李雪營，王傳明，趙 成，王海瓊

(黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558000)

水藥八角蓮為小檗科鬼臼屬植物八角蓮[D.versipellis(Hance)M.Cheng ex Ying]、小八角蓮[D.difformis(Hemsl.et Wils.)T.H.Wang ex Ying]、六角蓮[D.pleantha(Hance)Woodson]、川八角蓮[D.veitchii(Hemsl.ex Wils)Fu ex Ying]、云南八角蓮[D.aurantiocaulis(Hand.-Mazz.)Hu]的干燥根及根莖，為我國特有的藥用植物[1]。八角蓮以鬼臼之名始載于《神農本草經》，性涼，味甘，微苦，有小毒。具有清熱解毒、化痰散結、祛瘀消腫的功效，可用于治療癰腫、疔瘡、瘰疬、喉蛾、跌打損傷、蛇蟲咬傷等[2]。現代藥理研究表明，八角蓮具有抗腫瘤[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]和抗蛇毒等作用。但是八角蓮具有細胞毒性，民間常有因攝入過量致中毒或死亡的報道[6]。有毒副作用的藥物，經過炮制可明顯降低，甚至消除其毒性或副作用，從而確保用藥安全[7]。本實驗采用正交試驗法，依據《中國民族藥炮制集成》[8]對八角蓮的姜制工藝進行優化。

1 實驗部分

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；BT-600電子天平(啟東有銘衡器有限公司)；電爐(廣西灌陽縣元利電器廠)；KQ-3200超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；2500C多功能粉碎機(永康市艾澤拉電器有限公司)；JA2003N電子天平(上海菁海儀器有限公司)。

1.2 試劑

鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚的標準品(北京百靈威科技有限公司，編號分別為131142、203057、268623、258643)；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；生姜(都勻市斗篷山路沃爾瑪超市)。

1.3 試藥

對貴州都勻、羅甸等縣市的八角蓮屬藥材資源進行了野外考察和樣品收集，收集的樣品由黔南民族醫學高等專科學校生藥教研室王傳明副教授鑒定，分別為八角蓮[Dysosma versipellis(Hance) M.Cheng ex Ying]、貴州八角蓮[D. majorensis (Gagnep.)Ying]、川八角蓮[D. veitchii (Hemsl. et Wils.)Fu ex Ying.]和小八角蓮[D. difformis (Hemsl.et.Wils.)T.H. Wang ex Ying]。

2 方法與結果

2.1 HPLC測定鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚的含量

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：290 nm。流動相為A乙腈，B 0.1%磷酸。梯度洗脫條件：0～15 min,25%～30% A;15～25 min 30%～50% A[9]。色譜圖如圖1所示。

A. 醋制品;B.生品;C.混合標準品;1.4′-去甲基鬼臼毒素；2.槲皮素；3.山奈酚；4.鬼臼毒素。圖1 八角蓮HPLC色譜圖

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取鬼臼毒素對照品 15.300 mg、4′-去甲基鬼臼毒素對照品 0.212 mg、槲皮素對照品 1.490 mg、山奈酚對照品 2.040 mg，置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，振蕩均勻即可制成相應濃度的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取過三號篩(355 μm±13 μm，50目)的藥材粉末 1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入80%甲醇，料液質量比為1∶10。精密稱定質量，超聲 40 min,放置室溫，80%甲醇補足減失的質量，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液[9]。

2.2 姜制八角蓮炮制工藝優選

2.2.1 生八角蓮飲片制備

取八角蓮原藥材，除去殘莖及雜質，洗凈，潤透，切厚片，干燥，即得。

2.2.2 生姜汁的制備

稱取已切丁的生姜末 20 g，加水 100 mL(5倍量)于燒杯中，置于電熱套內煎煮 20 min,紗布過濾生姜汁；再加水 100 mL 繼續煎煮 20 min,合并生姜汁。將總生姜汁濃縮至 40 mL(0.5 g/mL)。

2.2.3 因素水平

根據八角蓮根莖的性質及查閱文獻，選取姜用量、悶潤時間、炒制時間為考察因素。經單因素考察確定因素水平，以鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚總含量為考察指標，采用L9(34)正交試驗法優選姜制八角蓮的炮制工藝，因素水平詳見表1。

表1 因素水平表

2.2.4 藥物的炮制

取八角蓮9份，每份 50 g，根據表1、表2安排，加入一定量姜汁置燒杯中，拌勻，悶潤。將悶潤后的藥物，置于預熱的炒鍋內，炒制定量時間后取出，晾涼，除去藥屑。試驗安排及結果見表2，方差分析見表3。每組平行制備3份。

表2 正交試驗安排及直觀分析

表3 姜制工藝方差分析

空白列D項為誤差項，表中R為極值，R值越大，則某個因素越重要。從表3方差分析結果可知，C(炒制時間)對試驗結果有較顯著影響，A(姜用量)、B(悶潤時間)影響不顯著。可以看出，最佳炮制工藝以第3組實驗即A1B3C3為佳，即姜用量5%，悶潤時間 60 min,炒制時間 12 min。

2.2.5 驗證試驗

為驗證該工藝的穩定性，按優選出的最佳工藝A1B3C3進行驗證性實驗，平行制備3份。測得4種指標成分總質量分數平均值為 10.6048 mg/g。結果表明，優選的八角蓮姜制工藝合理可行，制備的姜八角蓮飲片質量穩定。

3 小結

本研究首次對八角蓮進行了姜制的工藝研究，以八角蓮中指標性成分為指標，對姜用量、悶潤時間、炒制時間進行了考察，經直觀分析和方差分析得出影響八角蓮姜制的因素為：炒制時間>姜用量>悶潤時間。優選的姜制工藝為A1B3C3，即姜用量5%，悶潤時間 60 min,炒制時間 12 min。驗證性實驗表明，此工藝合理、可行，制備出的姜八角蓮飲片質量穩定可控，為八角蓮后期進行炮制減毒增效研究奠定了基礎。