基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的川貝母快速真?zhèn)舞b別技術(shù)研究*

徐曉可，鄧華明，余至興，黃逸儀，徐發(fā)蓮，梁惠倩，黃啟紅

(1.廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510663；2.廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所，廣東 廣州 510070)

川貝母是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有化痰止咳、抗菌和抗病毒等功效，廣泛用于中成藥[1-2]。川貝母的正品包括川貝母、甘肅貝母、暗紫貝母、瓦布貝母、梭砂貝母和太白貝母。易與川貝母混淆的有伊貝母、平貝母浙貝母和湖北貝母。由于川貝母的藥用價(jià)值高，療效顯著，但資源銳減，市場(chǎng)上以浙貝母、伊貝母、平貝母和湖北貝母等偽品混充川貝母的現(xiàn)象十分普遍，影響了藥品的安全有效性[3]。藥典規(guī)定川貝母的鑒別包括了性狀鑒別和PCR-RFLP法。傳統(tǒng)的性狀鑒別方法需要豐富的經(jīng)驗(yàn)積累，PCR-RFLP鑒別步驟繁雜、耗時(shí)長(zhǎng)，且需要大型儀器。因此，建立一種快速和特異的方法鑒別川貝母，對(duì)中藥材市場(chǎng)的監(jiān)管及中醫(yī)中藥的健康發(fā)展至關(guān)重要。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop Mediated Isothermal Amplification ，LAMP)[4]是一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異引物，利用一種鏈置換DNA 聚合酶在等溫條件(63 ℃ 左右) 反應(yīng)30～60 min，可通過肉眼直接觀察反應(yīng)結(jié)果，具有操作簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)和靈敏等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床疾病的診斷、細(xì)菌以及病毒等的檢測(cè)[5-8]。

本文通過比較分析川貝母保守性序列及其常見偽品的序列差異，設(shè)計(jì)LAMP引物，并篩選LAMP引物，構(gòu)建LAMP反應(yīng)體系，建立川貝母LAMP快速、特異和操作簡(jiǎn)單的鑒別技術(shù)，為中藥材市場(chǎng)的監(jiān)管提供技術(shù)支撐，促進(jìn)中醫(yī)中藥的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 藥材

川貝母(批號(hào) 121000-201108)、伊貝母(批號(hào) 120929- 201005)、平貝母(批號(hào) 120924-201410)、浙貝母 (批號(hào) 120972-201405)和湖北貝母(批號(hào) 120962-201005)，均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；太白貝母和暗紫貝母購自藥材店，均經(jīng)過藥典方法鑒定。其他市售川貝母樣品30 批(編號(hào)依次為GZ-1至GZ-30)，購自廣州市各藥材店。

1.2 主要試劑

新型植物基因組DNA 提取試劑盒(DP320)，購自北京天根生化科技有限公司；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法 DNA 擴(kuò)增試劑盒，購自廣州迪奧生物科技有限公司；DNA Marker和GelRed 核酸染料，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PrimeSTAR Max Premix(2×)和SmaI限制性核酸內(nèi)切酶，購自TaKaRa公司。

1.3 主要儀器

移液槍，德國(guó)Eppendorf公司；低溫高速離心機(jī)(SIGMA 3K30)，德國(guó)sigma公司；恒溫水浴鍋(XMTD-8222)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PCR儀(Mini3220)，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；電泳儀(DDR-6B)，北京六一生物科技有限公司；酶標(biāo)儀(EPOCH2)，美國(guó)BioTek公司；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-4600SF)，上海天能科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 DNA抽提

1)樣品前處理：川貝母、伊貝母、平貝母、浙貝母和湖北貝母粉末直接用于 DNA 提取。其他樣品依次用75%乙醇 1 mL、滅菌超純水 1 mL 清洗，吸干表面水分，置研缽中研磨成極細(xì)粉，備用。

2) DNA抽提：按照試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)

1)LAMP引物設(shè)計(jì)：比較分析川貝母保守性序列及其常見偽品的序列差異，利用LAMP軟件設(shè)計(jì)LAMP引物(表1)，由上海生物工程公司合成。

表1 本研究用引物序列

2)PCR-RFLP引物：參考《中華人民共和國(guó)藥典》，由上海生物工程公司合成。

1.4.3 LAMP擴(kuò)增

LAMP反應(yīng)體系 25 μL，包括 12.5 μL 2×反應(yīng)液(RM)、 0.5 μL 上游外引物F3(10 μmol/L)、0.5 μL 外引物B3(10 μmol/L)、2 μL 上游內(nèi)引物FIP(40 μmol/L)、2 μL 下游內(nèi)引物BIP(40 μmol/L)、1 μL Bst DNA聚合酶(8U)、2 μL DNA模板，加dd H2O至體積 25 μL，加入 1 μL 顯色劑在PCR管蓋。擴(kuò)增反應(yīng)條件：63 ℃ 恒溫水浴 1 h，不用開蓋，通過顏色直接觀察結(jié)果。

1.4.4 PCR-RFLP反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系和酶切反應(yīng)參考《中華人民共和國(guó)藥典》[9]。

1.4.5 LAMP引物篩選

以川貝母和伊貝母基因組 DNA為模板，進(jìn)行LAMP 反應(yīng)，觀察結(jié)果，篩選3套候選引物。

1.4.6 LAMP特異性驗(yàn)證

分別以 3種川貝母和7 種常見混淆品基因組DNA為模板，進(jìn)一步驗(yàn)證篩選引物L(fēng)AMP的特異性。

1.4.7 LAMP靈敏度評(píng)價(jià)

DNA抽提試劑盒抽提川貝母DNA，酶標(biāo)儀測(cè)定DNA濃度，梯度稀釋DNA，LAMP擴(kuò)增，評(píng)價(jià)其靈敏度。

1.4.8 市售川貝母樣品的檢測(cè)

購買廣州藥店市售川貝母樣品30份，提取DNA，分別進(jìn)行LAMP和PCR-RFLP檢測(cè)，比較結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 LAMP引物篩選

以川貝母和伊貝母基因組DNA為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)(圖1)。檢測(cè)結(jié)果顯示，Set1和Set2套引物不能區(qū)分川貝母和伊貝母，都出現(xiàn)了綠色陽性結(jié)果，可能會(huì)將川貝母?jìng)纹疯b定為正品。Set3套引物可以區(qū)分川貝母和伊貝母，其中川貝母顯示綠色陽性結(jié)果，伊貝母顯示橙色陰性結(jié)果。因此確定選擇引物 Set 3為川貝母LAMP鑒定引物。

1.Set1引物川貝母模板；2.Set1引物伊貝母模板；3.Set2引物川貝母模板；4.Set2引物伊貝母模板；5.Set3引物川貝母模板；6.Set3引物伊貝母模板。圖1 LAMP引物篩選

引物設(shè)計(jì)對(duì)LAMP特異性鑒定至關(guān)重要。劉香香等[10]基于川貝母保守性序列及其常見偽品的序列差異，通過突變方式設(shè)計(jì)了 1 對(duì)川貝母特異性引物，建立了川貝母 PCR 鑒定技術(shù)。錯(cuò)配堿基的引入增加了鑒別的特異性和準(zhǔn)確性。本文分別以川貝母JF778850序列和川貝母GQ205120序列設(shè)計(jì)了兩套LAMP引物(Set1和Set2套引物)，結(jié)果特異性都不理想。然后對(duì)比川貝母及其混偽品的ITS序列的差異，本文在Set2套引物的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了1條川貝母特異性引物(Set3FIP)。該引物在 3′端引入了1個(gè)錯(cuò)配堿基(5-CCGCAAATCGTGCCCGGAGCACTATGCCCGCCCTACC-3’，引入的錯(cuò)配堿基標(biāo)記下劃線)。實(shí)驗(yàn)表明，Set3套引物能準(zhǔn)確的鑒別川貝母和伊貝母，可以用于下一步的特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)。

2.2 LAMP特異性

利用篩選的Set3套引物分別擴(kuò)增3種川貝母和 7 種常見混淆品基因組DNA，檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示。其中，3種川貝母均為陽性，顯色反應(yīng)呈現(xiàn)綠色；7 種常見混淆品均為陰性，顯色反應(yīng)呈現(xiàn)橙色。說明該LAMP引物僅針對(duì)川貝母產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，對(duì)伊貝母、平貝母和浙貝母等的DNA未產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，LAMP擴(kuò)增的特異性良好，可用于川貝母的特異檢測(cè)。

1.川貝母；2.暗紫貝母；3.太白貝母；4.平貝母；5.伊貝母；6.浙貝母；7.湖北貝母；8.土貝母；9.新疆貝母；10.東貝母；11.空白對(duì)照。圖2 LAMP特異性結(jié)果

2.3 LAMP靈敏度

川貝母基因組DNA的質(zhì)量濃度為 40 mg/L。梯度稀釋DNA，LAMP擴(kuò)增。結(jié)果表明，LAMP的靈敏度為 32 μg/L(圖3)，即該方法的靈敏度可達(dá)到 0.1%。

1. 3.2 mg/L；2. 0.32 mg/L；3. 32 μg/L；4. 3.2 μg/L ；5. 0.32 μg/L；6.空白對(duì)照。圖3 LAMP DNA靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 市售川貝母樣品的檢測(cè)

30份市售川貝母樣品，LAMP方法檢出29份川貝母陽性樣品，結(jié)果與PCR-RFLP方法一致，但比傳統(tǒng)方法的檢測(cè)時(shí)間大大縮短(部分結(jié)果見圖4和圖5)。

1.GZ-1；2.GZ-2；3.GZ-3；4.GZ-4；5.GZ-5；6.GZ-6；7.空白對(duì)照；8.陽性對(duì)照。圖4 市售川貝母樣品LAMP檢測(cè)結(jié)果

M.從上往下片段大小依次是：600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp；1.陽性對(duì)照；2.陽性對(duì)照；3.GZ-4；4.GZ-4；5.空白對(duì)照。圖5 市售川貝母部分樣品PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了川貝母的LAMP檢測(cè)方法。建立的方法具有操作簡(jiǎn)單、快速和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。靈敏度為 32 μg/L，應(yīng)用于市售川貝母樣品快速篩查檢測(cè)，結(jié)果與《中華人民共和國(guó)藥典》PCR-RFLP方法一致，簡(jiǎn)便快捷，具有較好的推廣應(yīng)用前景。