液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中糖皮質激素類藥物殘留

黃婷，譚磊，何玉榆，陳彤，丁燕玲，鐘名琴*

(1.深圳市質量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監督管理局食用農產品監管重點實驗室，廣東 深圳 518000)

糖皮質激素(glucocorticoid，GCS) 又名“腎上腺皮質激素”，具有調節人體三大物質(糖、蛋白質、脂肪)代謝的生理作用，還能調節鉀、鈉和水的代謝，用來維持機體內外環境的平衡，是機體應激反應最主要的調節激素，也是臨床上最常用和有效的抗炎、免疫抑制劑[1]。常見的糖皮質激素類藥物主要是地塞米松、倍他米松，若人長期使用可能會出現不良反應，還可能會降低機體免疫力，人類食用后可導致機體代謝紊亂和發育異常，或潛在致癌、致畸風險[2]。目前，糖皮質激素常被用于治療家畜的炎癥反應、免疫性疾病、牛的酮病等，屬于生產常用的藥物。糖皮質激素的非法用途是為了增加家畜的采食量，從而達到增重的目的。因此，世界各國都制定了對于動物源性食品中各種激素的最大殘留量，歐盟第96/22/EC 指令、美國食品與藥品管理局、日本政府都禁止在食品源性動物中使用激素類藥物[3]。我國GB31650-2019 《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》規定，豬肉中地塞米松的最大殘留量為1.0 μg/kg，倍他米松的最大殘留量為0.75 μg/kg[4]。

目前，測定動物源性食品中糖皮質激素類藥物殘留的方法主要有酶聯免疫法、高效液相色譜法[5]和液相色譜-串聯質譜法。其中，酶聯免疫法只能用于篩查，液相色譜法的檢測項目比較單一，靈敏度低，耗時長，選擇性和特異性差，已達不到用于痕量獸藥殘留分析的要求。液相色譜-串聯質譜法是一種分析動物源性食品中痕量獸藥殘留的重要方法，具有靈敏度高、選擇性和特異性好的特點，對低濃度樣本有很好的檢測率，還可用于測定不同基質中的糖皮質激素類藥物。針對動物源性食品，常用標準的前處理過程耗時長[6]，經濟成本高，過程繁瑣，不能滿足目前對動物源性食品的高效、快速檢測的需求。為加強對動物源性食品獸藥的監控，有效監督我國獸藥濫用質量現狀，我們對糖皮質激素類藥物中的地塞米松、倍他米松進行檢測，前處理過程操作簡單，耗時短，有機溶劑用量少，成本低，還能將兩物質進行分離，且結果可靠，靈敏度高，檢出限低。

1 材料與方法

1.1 樣本準備

取適量新鮮豬肉組織，將其充分絞碎且均質，-20 ℃避光保存。

1.2 儀器

TQ-XS 液相色譜-串聯質譜聯用儀(美國Waters 公司)、多管漩渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司)、電子天平(感量0.01 g、感量0.000 1 g) [ 梅特勒托利多(Mettler Toledo) 集團]、3K15冷凍離心機[ 適馬(Sigma)股份有限公司]、Millipor 超純水儀、奧特賽斯AS 系列超聲波清洗機、OAN-EVAP 24 型可控溫的氮吹濃縮儀。

1.3 主要試劑與耗材

1.3.1 實驗室用水

符合GB/T 6682《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水。

1.3.2 試劑

甲醇(CH3OH)、乙腈(C2H3N)、甲酸(HCOOH)為色譜純，購自德國默克公司。

1.3.3 乙腈水提取溶液

乙腈水提取溶液：80%乙腈水+0.2%甲酸。

甲醇水復溶液甲醇+水+甲酸（10 ∶90 ∶0.09，V/V/V）。

Waters PRIME HLB(6 cc，200 mg)固相萃取柱(美國沃特世公司)；

濾膜(津騰，0.22 μm，水系)；

標準物質：地塞米松、倍他米松(純度＞98%，購自德國DR 公司)。

1.4 標液配制

準確稱適量的地塞米松、倍他米松的標準品，用甲醇分別配成100 μg/mL 的標準儲備液，-18 ℃冰箱中保存，有效期6 個月；分別移取適量地塞米松、倍他米松標準儲備液，用甲醇逐級稀釋成適當濃度的地塞米松、倍他米松標準工作液，置于-18 ℃冰箱中保存。

1.5 樣本前處理

準確稱取試樣2.00 g 于50.00 mL 離心管內，加入10.00 mL 乙腈水提取溶液，震蕩搖勻30 s，超聲波清洗儀超聲5 min，于高速離心機8 000 r/min 離心5 min，備用。

于上述離心后提取液中移取4.00 mL 上清液過Waters PRIME HLB 固相萃取柱，保持1 滴/s 的速度。移出2.50 mL 至15 mL帶刻度的離心管中。流出液在40 ℃水浴下氮氣吹至少于0.50 mL。殘留液用甲醇水復溶液定容至1.00 mL，震蕩2 min，過0.22 μm 濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 液相色譜條件

a)色譜柱：BEH C18(100 mm×3.0 mm，1.7 μm)(美國Waters 公司)；

b)流速：0.30 mL/min；

c)柱溫：40 ℃；

d)進樣量：2.00 μL；

e)流動相及梯度洗脫程序(表1)。

1.6.2 質譜參考條件(表2、圖1、圖2)

a) 離子源：電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)；

b)掃描方式：負離子掃描；

c)檢測方式：多反應離子監測(multiple reaction monitoring，MRM)；

d)毛細管電壓：1.00 kV；

e)離子源溫度(TEM)：550 ℃；

f)去溶劑氣體流量：氮氣，1 000 L/h；

g)碰撞氣：氬氣。

2 結果

2.1 標準曲線

按方法條件設置儀器參數，量取適量糖皮質激素類藥物標準溶液，將其用空白基質溶液制備成濃度為0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL 的混合系列標準工作溶液進行上機測定，繪制標準曲線[7]，測得地塞米松的相關系數為0.999 2，倍他米松的相關系數為0.999 6。

圖1 陰性樣本添加0.50 ng/mL 地塞米松離子通道色譜圖

圖2 陰性樣本添加0.50 ng/mL 倍他米松離子通道色譜圖

2.2 方法檢出限測定(表3)

以空白豬肉樣本為基質，添加濃度為0.50 μg/kg，按照“1.5 樣本前處理”中介紹的試驗方法處理和測定，平行樣本7 個(n=7)，根據各樣本檢測值計算出平均值及標準偏差。再根據公式檢出限MDL=(k×Sb×C)/X(式中：k 為置信因子，一般取3)，測定地塞米松、倍他米松檢出限分別為0.046 4 μg/kg 和0.047 3 μg/kg。

2.3 回收率及精密度確定(表4)

用空白豬肉樣本進行0.50、1.00 和5.00 μg/kg，3 個水平陽性添加回收實驗，每個水平取6 個平行樣，按“1.6.2 質譜參考條件”處理和測定。地塞米松、倍他米松平均回收率和相對標準偏差結果見表1。3 個水平的陽性添加回收率為76.2%～100.4%，相對標準偏差為1.5%～4.8%。

3 結論

本試驗建立了一種檢測動物源性食品中糖皮質激素的液相色譜串聯質譜的測定方法。結果表明，該方法解決了現行檢測方法定性定量過程繁瑣復雜、耗時長的問題，節省了人力、物力和財力，具有前處理過程簡單、溶劑使用量少、穩定性好、定量準確等優點[8]，能滿足對動物源性食品糖皮質激素類藥物進行快速定性定量檢測的要求，為獸藥殘留防控監管提供強有力的技術支撐。