mTOR 在SD 大鼠TMJOA 髁突軟骨中表達變化的實驗研究

王子涵，葉改映，趙 濤，張 俊，胡 瑜

（昆明醫科大學 口腔醫學院，云南 昆明 650500）

顳下頜關節骨關節炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是一種常見的口腔頜面部疾病，臨床癥狀包括顳下頜關節（temporomandibular joint，TMJ）區疼痛，腫脹，張口受限，咀嚼效率低下等，嚴重影響人類的健康和生活質量[1]。TMJOA 是多種致病因素所導致的結果，目前病因尚不完全清楚。TMJOA 典型病理變化包括髁突軟骨細胞凋亡，軟骨基質降解以及軟骨下骨骨質改變等，其中關節軟骨的退行性變是OA 病理變化的核心[2]。且在OA 中，自噬在抑制軟骨細胞凋亡的啟動過程發揮關鍵的調控作用[3]。自噬轉導信號網絡及其介導的自噬過程錯綜復雜，包括P13K/Akt、mTOR、MAPK、和NF—KB 信號通路等[4]。有很多研究證據表明，使用哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑[5]或或 mTOR 基因特異性敲除[6]的動物模型中，OA 的病程明顯減輕，這也使得通過調控mTOR 來治療TMJOA 成為一個重要的研究方向。本實驗將構建偏側咀嚼導致的大鼠TMJOA 動物模型，進一步檢測mTOR 在髁突軟骨中的表達，探討自噬對TMJOA 病程的影響，加深理解TMJOA 的發生、發展，對探索相應的治療方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物8 周齡清潔級實驗動物（sprague dawley，SD）大鼠購于昆明醫科大學動物實驗中心[合格證編號：SCXK（滇）K2020-0004]，飼養于昆明醫科大學SPF 動物實驗中心，體重（250±25）g，普通清潔環境，自由活動，給予足量食物和水。

1.1.2 主要試劑及實驗設備正畸絲（杭州西湖材料有限公司，浙江）；蘇木素染液（珠海貝索生物技術有限公司，廣東）；改良番紅O-固綠軟骨染色液（索萊寶，北京）；兔抗SOX9（SRY-related high mobility group-box gene9）抗體（正能生物380995）；兔抗mTOR 抗體（ORIGENE TA325696）；DAB 顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，福建）；石蠟切片機（Leica，德國）；光學顯微鏡（CARL ZEIS，德國）。

1.2 實驗動物分組及建模方法

1.2.1 動物選擇及分組選用45 只無明顯口腔頜面部疾病的8 周齡健康雄性SD 大鼠。將27 只大鼠按偏側咀嚼2、4、8 周隨機分為3 個組，每組9 只；同時設立相應假手術對照組，每組6 只。

1.2.2 建模方法大鼠于手術前夜禁食禁水，提前一天配置好3%戊巴比妥備用。手術時按每只大鼠1.5 mL 麻醉量進行麻醉，麻醉起效后，固定大鼠，并牽拉上下頜切牙及舌頭以暴露下頜牙列，固定其開口狀態。用持針器持一段長2 cm 的正畸絲從右側下頜第一磨牙近中舌側牙間隙穿入，纏繞牙頸部一圈，并在舌面將兩頭正畸絲纏繞打結固定。實驗組將正畸絲結彎曲至牙合面并保留一定長度以造成咬合障礙；對照組將正畸絲彎曲至于鄰牙舌面頸部貼合，無咬合障礙，后用探針檢查穩定情況。實驗組大鼠右側耳朵減去小三角瓣作為標記，對照組不做標記。建模后，定期檢查正畸絲的穩固情況和完整度。

1.2.3 取材、脫鈣、脫水及包埋建模后2、4、8周分別取材，用脫頸椎處死法處死大鼠，完整切取大鼠右側顳下頜關節髁突組織，用生理鹽水沖凈后以4%多聚甲醛固定液固定于標記好的EP 管中，固定48 h 后將標本放入組織標本盒中，自來水沖洗過夜。沖洗后用快速脫鈣液進行脫鈣，每四小時檢查一次脫鈣程度，待完全脫鈣后流水沖流過夜。將沖洗好的的髁突組織依照70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各浸泡6 min 以脫水，再浸泡入二甲苯Ⅰ30 min、二甲苯Ⅱ15 min 以透明。脫水完畢后將髁突組織取出，依次放入60 ℃恒溫烘箱中的熔融石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各60 min（浸蠟時間隨大鼠周齡增加可適當延長）。將浸好蠟的組織容納盒放入包埋機蠟池中，用鑷子將髁突組織平放于金屬包埋盒底，滴滿石蠟，蓋上塑料包埋框盒，標號序列放于冷凍機上冷凍。待石蠟完全凝固后除去多余部分。

1.2.4 組織化學染色進行病理學檢查組織蠟塊修整后常規切片、脫蠟、水化后行蘇木素-伊紅和番紅-固綠染色。應用改良Mankind 評分和國際骨關節炎研究協會（OARSI）評分評估大鼠TMJ軟骨病損程度。

1.2.5 免疫組織化學染色法測定髁突軟骨細胞中SOX9 及mTOR 的表達組織蠟塊修整后常規切片、脫蠟、水化后，通過ABC 法進行染色。SOX9 染色一抗為兔抗SOX9（稀釋1∶200），mTOR 染色一抗為兔抗mTOR（稀釋1∶100），所有切片用兔生物素化的二抗孵育，DAB 顯色，蘇木素復染。固定封片后用光學顯微鏡拍攝，應用imageproplus 選取3 個樣本計算軟骨細胞的平均光密度值（AOD 值），其平均值作為該組的平均光密度值。所有切片放在相同的載玻片上，在相同條件下共同進行處理。

1.3 統計學處理

使用 Graphpad Prism9.0 統計軟件對實驗結果數據進行作圖統計學分析。采用完全隨機設計的方差分析（one-way ANOVA）檢驗，所有數據顯示為均數±均數的標準差（mean ± SD）。P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 髁突軟骨形態

蘇木精-伊紅（HE）染色顯示，髁突的軟骨結構由內向外可依次分為鈣化軟骨層、肥大層、增殖層和纖維層。番紅O-固綠染色顯示，對照組大鼠的髁突軟骨結構層次清晰，表面平整，蛋白多糖分布均勻。

隨著時間推移，實驗組（TMD 組）大鼠的髁突軟骨結構出現明顯的退行性病變。實驗2 周組HE 染色顯示軟骨組織表面略不均勻；番紅O-固綠染色顯示蛋白多糖非均質性染色。實驗4 周組HE 染色顯示軟骨組織表面不均勻層及水平裂隙，軟骨層變薄，肥大層細胞減少，部分標本出現表層纖維化和無細胞區。番紅O-固綠染色顯示蛋白多糖染色進一步丟失，番紅O 淡染。實驗8 周組軟骨組織表面粗糙，裂隙增大，軟骨細胞排列紊亂，可見無細胞區。番紅O-固綠染色顯示蛋白多糖非均質性染色，表層和中深層失染（圖1、2）。改良Mankin 評分[7]和OARSI 評分[8]結果顯示，對比對照組，實驗組（TMD 組）評分明顯升高（P＜0.05），且病損評分在4 周時最高，8 周略有回落（圖3）。

圖1 大鼠顳下頜關節 HE 染色（50×）Fig.1 HE staining of TMJ in rats（50×）

圖2 大鼠顳下頜關節番紅-固綠染色（50×）Fig.2 HE staining of TMJ in rats（50×）

圖3 大鼠顳下頜關節組織病理學評分Fig.3 Histopathological scores of TMJ in rats

2.2 髁突軟骨中蛋白質SOX9 和mTOR 的表達

SOX9 作為軟骨細胞增殖、分化的重要調控因子，其表達水平反映了顳下頜關節的生長改建情況，免疫組織化學染色顯示SOX9 陽性細胞主要在細胞核呈棕色染色（圖4）。實驗過程中隨著異常生物力學刺激的增加，實驗2 周（P＜ 0.01）、4 周（P＜ 0.05）、8 周（P＜ 0.05）組大鼠髁突軟骨中SOX9 表達水平呈依次下降且均低于對照組的趨勢（圖5）。

圖4 SOX9 免疫組化染色（100×）Fig.4 Immunohistochemical staining of SOX9（100×）

圖5 mTOR 免疫組化染色（100×）Fig.5 Immunohistochemical staining of mTOR（100×）

mTOR 作為髁突軟骨細胞的自噬抑制因子，在顳下頜骨關節炎中影響細胞的自噬凋亡，免疫組織化學染色顯示mTOR 陽性細胞主要在細胞質呈棕色染色。實驗過程中隨著骨關節炎病情發展，實驗組mTOR 表達水平呈2 周（P＜ 0.01）、4 周（P＜0.001）下調，8 周（P＜ 0.05）上調的趨勢（圖6）。

圖6 SOX9 和mTOR 免疫組化染色強度分析Fig.6 Immunohistochemical staining intensity of SOX9 and mTOR

3 討論

雖然TMJOA 具體病因和發病機制尚不清楚，但研究表明過度的機械負荷可能是影響OA 發生發展的重要因素[9]，因此偏側咀嚼常被用于制作一種廉價、高效、貼近于實際病理環境的小鼠顳下頜關節骨關節炎模型[10]。在本研究構建的大鼠TMJOA 模型中，通過對髁突組織進行HE 染色和番紅固綠染色可見軟骨組織表層不平整，出現裂隙；軟骨層變薄，軟骨細胞層次紊亂，部分標本出現表層纖維化和無細胞區；蛋白多糖非均質性染色，表層和中深層失染，提示使用偏側咀嚼構建SD 大鼠TMJOA 模型的方法得以成立。另外，在本研究中，通過對髁突組織進行免疫組織化學染色可以觀察到，實驗2、4、8 周組大鼠髁突軟骨中SOX9 表達水平依次下降且均低于對照組，進一步顯示了實驗組大鼠骨關節炎的炎癥加重情況。

目前的研究認為，骨關節炎中軟骨細胞凋亡的增加在骨關節炎的發病機制中居于中心地位和始動環節[11]。自噬在抑制軟骨細胞凋亡的啟動過程中，發揮關鍵的調控作用。當細胞器受損時，自噬被激活，從而清除受損細胞器，抑制凋亡、促進修復，延緩OA 的病程[12]。

研究表明，在OA 病程中尤其是發病的早期階段，軟骨細胞的自噬水平（特別是淺層軟骨）是明顯增高的，并且通過對凋亡及活性氧的調控影響OA 相關基因的表達[13]，Bouderlique T 等[14]使用Atg5cKO 鼠研究增齡性和創傷性OA 時，發現抑制軟骨細胞的自噬可以使凋亡增加，加速增齡性OA 的進程。Zhang M 等[3]通過改變機械應力誘導顳下頜關節軟骨的退變，發現自噬增強，mTOR 和MAP4K3 活性受抑制而降低。表明在OA 中自噬在抑制軟骨細胞凋亡的啟動過程發揮關鍵的調控作用。

經研究發現，mTOR 是一種自噬重要的負調節因子，軟骨的生長發育以及 OA 的病程均與mTOR 介導的信號通路密切相關。有很多研究證據表明，在使用 mTOR 抑制劑[5]或特異性敲除mTOR 基因[6]的動物模型中，OA 的嚴重程度顯著降低。在筆者構建的大鼠TMJOA 早期模型（2W）中，也可以觀察到mTOR 的表達受到了抑制，提示了在TMJOA 早期，自噬程序被激活而凋亡程序受到抑制，減少了早期炎癥造成的顳下頜關節軟骨損失。

但隨著炎癥的進展，建模4 周時mTOR 明顯下調，而改良Mankin 和OARSI 評分顯示，與對照組相比，實驗組（TMD 組）評分明顯升高，且病損評分在此時達到最高，這可能是由于短暫增加的自噬是對細胞應激的一種補償反應，但當長期應激超過該機制的能力時，就造成了嚴重的損傷[15]。

建模8 周后，mTOR 的表達又有回升的趨勢，這提示炎癥晚期，自噬受到抑制，而細胞的凋亡程序被激活，軟骨損失進一步加劇。

綜上所述，在筆者構建的TMJOA 大鼠模型中，炎癥早期，大鼠的mTOR 表達受到抑制，軟骨細胞的自噬被激活而凋亡受到抑制，促進退變軟骨修復，從而延緩了OA 的病理進程；但是到了炎癥晚期，mTOR 的表達被激活，軟骨細胞的自噬受到了抑制而逐漸向凋亡轉化，軟骨損失加重。mTOR 信號在生物力學誘導的TMJ OA 進展中，在將保護性自噬轉變為破壞性的凋亡中發揮了關鍵作用。

研究表明，僅是通過降解細胞外基質或抑制促炎因子往往不能減緩OA 的進程，但通過調節自噬，則可以改變軟骨細胞的基因表達，調控細胞的穩態機制，從而阻止細胞凋亡[16]。抑制mTOR 的表達，則可以激活軟骨細胞的自噬，抑制氧化應激和炎癥反應，從而達到治療 OA 的目的[6]。這也使得將 mTOR 作為TMJOA 的治療靶點成為一種有價值的研究方向。本實驗初步探討了機械應力造成TMJOA 后髁突軟骨細胞的病理特征和mTOR 的表達變化，為以后靶向藥物的研發提供一定的參考。