基于“同病異證”的肺系疾病代謝組學運用*

張晨曦，王海峰

(1.河南中醫藥大學2019級碩士研究生，河南 鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

代謝組學是對生物細胞和組織中的小分子代謝物(相對分子質量<1 000)進行識別、量化和剖析，鑒定可能改變細胞或生物體表型的生物標記物的一門學科[1]。近年來，學術界積極探索代謝組學的功能特征，并將其用于解決多方面的關鍵問題，如疾病的發病機制、藥物治療與發現、營養問題、農業問題、環境毒理學和微生物進化等[2]。中醫藥在治療疾病方面有著多靶點、個性化、兼容性、毒副作用小等優勢，具有良好的臨床療效[3]。然而，隨著中醫藥現代化的不斷進展，中醫藥診療的規范化和標準化成為急需解決的關鍵問題之一。基于證型差異的代謝組學研究能將中藥藥理與代謝組學技術相融合，篩選不同證型背景下的差異代謝物，尋找疾病的標志性生物分子，為臨床診療和評價方藥療效提供科學依據[4]。筆者總結概括了代謝組學技術在呼吸系統疾病中的運用與發展，著重突顯“同病異證”理論指導下的代謝物差異，旨在為中醫藥治療肺系疾病提供理論依據，推動中醫藥現代化研究技術不斷進展。

1 代謝組學研究進展

1.1 代謝組學概述

組學包括多個重點領域，如基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、表型組學和藥物基因組學等[5]。這些組學通常基于使用高通量分析方法和生物信息學對生物樣本進行全局分析，并可能提供對生物現象的新見解[6]。代謝物是細胞的基石，代謝組擁有大量能夠預測機體性狀的信息[7]。代謝組學是對病理生理或基因修飾等刺激產生的生物體代謝物質動態應答的定量測定，該概念于1999年由英國帝國理工大學Jeremy Nicholson教授首次提出[7]。代謝組學的最終目標是對生物體內低分子的綜合研究，生物和環境因素如藥物治療、營養、生活方式、遺傳影響或疾病等均可導致體內代謝物的時間動態變化和物種改變，因此，代謝組學為研究機體內在變化和外在表達提供了巨大的潛力[8]。代謝組學研究的工作流程包括樣本采集、樣本制備、化學分析/檢測、數據處理、統計分析和生物解釋等。代謝組學要求代謝物篩選要有非選擇性(擴大檢測覆蓋面)、檢測過程步驟少且快速(檢測到盡可能多的代謝物質)、步驟可重復性、代謝終止(使用低溫、加酸或快速加熱阻止代謝終止)。目前，代謝組學技術參與疾病研究已涉及心腦血管及內分泌系統、消化系統等多個方面，確定能夠診斷和預測疾病發生發展的生物標志物，尋找藥物作用的通路[9]。有研究通過液質色譜-質譜法(LC-MS)聯用技術，對健康人和早期阿爾茨海默病患者的血漿樣本進行檢測，結果得出膽堿能系統、能量代謝，以及氨基酸、脂質通路可能參與早期阿爾茨海默病的發展[10]。有學者通過氣相色譜-質譜法(GC-MS)分析對比抑郁癥患者的血漿標本，發現草酸和硬脂酸組合有望作為診斷抑郁癥的生物標志物[11]。Debik J通過核磁共振(NMR)發現原發性乳腺癌患者中期和晚期階段的血清代謝物對預測患者的生存期有顯著意義[12]。Dong S[13]使用LC-MS技術分析尿液樣本，證明能量和氨基酸代謝通路及磷酸戊糖通路參與了非酒精性脂肪肝的病理過程。

1.2 代謝物檢測平臺

在數量眾多的代謝物中，只有少數可以從全局分析中識別出來，極少數可以從目標分析中識別出來，經常進行定量分析的代謝物數量更少[14]。因此，代謝物的數量和結構多樣性構成了檢測和注釋方面的一大挑戰，其結果準確性和真實性將在很大程度上取決于代謝組數據存儲庫和相關數據分析工具的使用[15]。代謝組學技術分析主要基于兩個平臺，即NMR和質譜(MS)。隨著技術發展和市場需求，有4種技術被廣泛應用，即NMR、LC-MS、超性能液相色譜-質譜(UPLC-MS)和GC-MS[16]，這4種技術彼此并不沖突，而是在所覆蓋的生物面上相互補充和延伸，為生物醫學和生物技術的代謝領域提供了更廣泛的研究方向[18]。目前，NMR的研究主要集中在氫譜和碳譜兩類原子核的波譜，NMR 數據在很寬的動態范圍內具有高度的可重復性和定量性，對于確定未知物的結構方面具有很大優勢，無需復雜的樣品制備或分級分離，但具有較低的相對靈敏度和有限的動態范圍。NMR所適用的樣本較為廣泛，如血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、滑膜液、羊水、腹水，以及各種組織提取物如腫瘤、大腦、肌肉[17-18]。MS是一種測量離子質荷比的方法，因其具有高特異性和高靈敏度，且操作簡單，檢測樣本量少等特點被廣泛用于能源、化工、醫學等多個學科，常與色譜技術相連用，如LC-MC和GC-MC，此兩者具有敏感性強、覆蓋率高的特點[15]。大多數疏水性且極性大的物質如有機酸類、核苷類、核苷酸類物質使用LC-MS進行分析，揮發性有機化合物、脂類和可衍生分子的分析是使用GC-MS進行分析的[19]。然而，無論是LC-MS還是GC-MS，都存在著相似的缺陷，其分離技術的關鍵性、樣品制備的必要性(如蛋白質沉淀和衍生化)，以及分析特定基質的難度會降低其重復性，增加該平臺的工作和時間要求[20]。除此之外，代謝物檢測范圍可分為靶向與非靶向[21]。兩者相比，靶向分析主要是為了支持一個特定的生物學假設，涉及識別和量化有限數量(數十到數百)的已知代謝物或一組代謝物，涉及一個或幾個特定的代謝途徑，這種靶向代謝與臨床中通過化學檢驗對體液、血液中的小分子測量十分相似[22]；而非靶向方法可以對生物樣品中所有的代謝物進行全局檢測，提供了確定新生物標志物的潛力[23]。

1.3 樣本收集與數據處理

代謝物質具有動態性演變、復雜化、量大多樣的特點，又易受內外因素干擾，因此，對樣本的采集和處理過程要求規范、嚴謹、科學，如血液、尿液等臨床樣本要嚴格統一樣本采集時間、工具及儲存條件等。根據研究類型的不同，樣品準備包括一些中間步驟的組合會有所區別，主要差異體現在代謝淬滅、樣品儲存、代謝物提取等過程[24]。尿液、血液、唾液、細胞、組織和培養液等均可作為生物樣品應用于代謝組學中[25]，當需要對尿液等含水生物流體樣本進行分析時，通常需要經過離心、稀釋，特別是嚙齒類動物的尿液樣品，需要蛋白質沉淀來保護色譜柱。對于血漿、血清等樣品來說，蛋白沉淀是必不可少的，固體樣本如組織、糞便等則需要根據樣品種類使用水溶劑、有機溶劑及水-有機溶劑的混合物對樣本進行優化提取[26]。根據分析平臺的不同對樣本的處理也有差別，如LC-MS通常要求使用有機提取液對樣品進行蛋白沉淀，達到停止代謝的目的，同時又能保留有意義的代謝物質；而對于GC-MS來說，樣本需要提前進行化學衍生之后才能進入分析流程，這是因為樣品需要在高溫環境下進行氣相色譜分離[27]。對于所得到的原始數據，通常會進行對數轉化、歸一化、缺失值填補、數據清理、過濾和標準化處理[16]，最終于代謝數據庫相比對進行生物注釋，通過主成分分析、富集通路分析等獲取有效信息[28]。

2 中醫證候與代謝組學

證候是中醫理論體系中的關鍵，是疾病過程中某一病理概括，圍繞證候進行辨證論治、理法立方是中醫診療的核心與精髓。證候具有整體性、模糊性、恒動性、時空序列性、時空動態性的特點[29-30]。因機體內部的邪正相爭、虛實轉換、寒熱互化或藥物、環境、飲食等刺激而動態演變，反映疾病在不同階段的內在病理特點和外在征象。從代謝組學觀點來看，在疾病的發生發展過程中，證候反映機體內在聯系和階段性病理病機，涵蓋了機體對致病因素的功能狀態，屬于機體內部穩態的改變[31]。代謝組學可以捕捉在內外環境影響下的機體器官、組織等產生的內源性代謝物，及其產生與作用機制[32]，具有整體性和動態性特點，與中醫證候本質相契合。由此，許多學者提出將代謝組學技術用于中醫疾病證候差異研究，通過篩選“同病異證”背景下機體所產生的代謝物，確定生物標記物和相關代謝通路，闡明其有效性和效用機制，能夠體現中醫理論的科學價值與實用價值[33]。“中醫證候相關代謝圖譜”為證候生物學基礎研究提供了新思路和新途徑[34]。隨著當前生命科學的全球化和“大數據”研發的到來，兩個知識層面在不斷地交融，多組學策略在中醫藥中的應用已經開始為中醫藥的本質和分子基礎提供新的見解[35]。臨床已有眾多學者將此理論應用于實踐，多集中于證型差異代謝物研究、中藥復方代謝研究、特定證型代謝研究等。本文主要以肺系疾病為主展開探討。

3 “同病異證”肺系疾病代謝差異研究現狀

3.1 支氣管哮喘

支氣管哮喘歸屬中醫學“哮病”范疇，又可稱為“喘鳴”“哮吼”。因外邪入侵、飲食不當等原因誘導喉中宿痰交搏壅于氣道所致。因發病機制、病理因素不同，有虛實之別、寒熱之分。在臨床上可分為急性發作期、慢性持續期和臨床緩解期。劉世剛等[36]收集20例哮喘慢性持續期患者的血清，采用GC-MS技術發現4-氨基丁酸、苯甲酰甲酸、異肌醇、二十四碳烷可作為哮喘虛寒證與虛熱證的差異代謝物，參與β-丙氨酸代謝通路，其中4-氨基丁酸可能是鑒別虛寒證和虛熱證支氣管哮喘慢性持續期的生物標記物。嚴興海等[37]采用NMR技術，對60例哮喘緩解期患者的血漿樣本進行檢測，數據顯示相對于肺氣虛證而言，腎氣虛證患者血漿中的亮氨酸、纈氨酸、乳酸、檸檬酸等代謝物下調，而丙酮、乙酰乙酸呈上調。有學者通過LC-MS 技術對患者尿液樣本進行檢測，發現L-酪氨酸、4-吡哆酸可能是腎氣虛證患者區別于健康人的生物標記物[38]。歷代醫家常說“小兒有陽無陰或陽盛陰微”，哮喘多發生于青少年時期，小兒哮喘發作期常見痰熱阻肺證、外寒內熱證和風寒束肺證[39]。陶嘉磊等[40-41]分別采用GS-MS/MS、LC-MS技術對痰熱證小兒的尿液標本進行代謝物檢測，發現痰熱證與其他證型相比，草酸、嘧啶、乙酰賴氨酸、琥珀酸等有機酸、酮類化合物呈下調趨勢，且與乙醛酸、甘氨酸、生物素等代謝途徑有關。也有研究發現，基于GS-MS技術分析的尿液樣本中，磷酸鹽、半乳糖酸、阿糖醇可作為小兒肺脾兩虛證和氣陰兩虛證的差異代謝物，參與機體能量、腸道菌群、氨基酸等代謝途徑[42]。

3.2 肺惡性腫瘤

肺癌總體屬于本虛標實，其病機不外乎臟腑氣血陰陽虧虛，氣滯、血瘀、痰濁、熱毒積聚而成。采用中醫藥措施干預肺癌，在臨床中有獨特的優勢。查閱相關文獻，發現肺癌的代謝組學研究更多體現在西醫學中，但也有不少中醫學者嘗試將中醫的證候與代謝組學相融合，力圖尋找證型差異下產生的生物標記物。周賢梅等[43]通過GC-MS技術在呼出氣冷凝液中發現，痰濕蘊肺證和氣陰兩虛證患者的代謝物有明顯的差異，3-氨基-2-苯甲酰基-4，5，6，7-四氫苯并[b]噻吩和1-(苯基磺酰基)吡咯分別為兩者所特有的化合物。馬俊杰等[44]通過GC-MS技術對非小細胞肺癌的病理組織進行檢測，發現虛證與實證相比，檸檬酸、乳酸、肌醇等含量明顯上調，纈氨酸、葡萄糖、谷氨酰胺酸等化合物明顯下調。陳卓等[45]通過LC-MS技術對非小細胞肺癌氣陰兩虛證患者的糞便標本進行檢測，有11種差異代謝物可以區別于健康人群，參與癌癥等相關通路。

3.3 肺炎與毛細支氣管炎

肺炎是一種由多種不同病原體引起的急性肺部感染，具有高發病率和病死率[46]，屬于中醫學“風溫肺熱”“咳嗽”范疇。基于代謝組學的研究，能夠更好地了解肺炎，發掘生物標志物有利于肺炎的準確診斷和風險分層[47]。有學者通過GS-MS技術發現，由病毒引起的肺炎風熱郁肺證患兒相比于健康兒童而言，其血清中的丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸等多種有機酸上調，而甘油、乙醇酸、氨基丁酸等呈下調趨勢[48]。亦有學者通過采集患兒尿液標本，采用GC-MS平臺，發現肉毒堿、嘧啶、果糖、1-蘇氨酸等代謝物可作為小兒毛細支氣管炎痰熱閉肺證與風熱閉肺證的差異代謝物，且兩者的代謝途徑有明顯的差異[49]。筆者發現，關于肺炎的代謝組學研究以小兒肺炎居多，這為后續進行成人肺炎代謝組學研究提供了啟發。

3.4 肺纖維化

肺纖維化是一種進行性、不可逆且通常致命的肺部疾病[50]。絕大部分患者發病原因不明，隨著病情和肺部損傷程度不斷的加重，肺功能進行性喪失，呼吸功能逐漸衰竭，且藥物療效有限。中醫藥在抗纖維化方面有獨特的優勢，能有效改善臨床癥狀，延緩疾病的進展[51]。然而，現有研究缺少大樣本、多中心的中醫證型肺纖維化代謝組學的臨床研究。部分學者嘗試使用LC-MS技術發現了磷脂酰膽堿、白三烯4、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB等成分可作為肺脾氣虛證為主的肺纖維化患者的潛在證候標志代謝物[52]。利用代謝組學技術可以幫助肺纖維化疾病的臨床診斷，評估疾病程度，甚至進行風險預測和靶點識別，更能為今后的臨床藥物研發提供新思路，提高對其發病機制的認知[53]。

3.5 慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(COPD)屬中醫學“喘證”“肺脹”范疇，因疾病不斷進展，肺、脾、腎受損所致，臨床常見肺氣虛證、肺腎氣虛證、肺脾氣虛證等虛證，亦見痰濁阻肺等實證。根據COPD的發展進程分為急性加重期和緩解期。張瑞等[54]采用LC-MS技術對60例痰濁阻肺證急性加重期的COPD患者血清標本進行檢測，發現與健康人群相比，乳酸、琥珀酸、葡萄糖等代謝物質在兩組人群種有明顯差異性，且痰濁阻肺證患者的氨基酸、能量和脂肪代謝有特異性改變。以同樣的技術手段對肺氣虛證COPD患者的血漿進行全譜氨基酸代謝組學檢測，發現同型半胱氨酸、肌肽、組氨酸、賴氨酸等多種代謝物質在患者診療過程中可以區分于健康人群[55]。關于COPD代謝組學的研究目前多體現在西醫臨床診療、不同發病階段的代謝物篩選、疾病發生機制等方面，中醫證候本質研究方面涉及較少。若能通過代謝組學鑒定協助COPD的證型診斷，將對COPD患者的臨床診斷、個體化規范診療、肺功能康復等具有重要意義。

4 小 結

目前，代謝組學技術已廣泛應用于多個學科，其敏感性、適用性、可靠性隨著科研需求在不斷優化。該技術有助于確定疾病的標記性代謝物和通路，通過差異代謝物區分同種疾病的不同證型，為評價中藥臨床療效和作用機制提供依據。在中醫證型理論指導下的呼吸系統疾病中醫藥臨床診療具有明顯的優勢和發展前景。代謝組學作為新興的技術領域，具有廣覆蓋、大數據、技術先進、可選擇性強、重復性高等特點。隨著中醫藥現代化的推進，兩學科領域的相互交融能夠推動肺系疾病的臨床診斷、療效評價、風險預測、藥物研發等多方面的進一步深入，從而為中醫藥的臨床診療和廣泛應用提供新思路。但目前的代謝組學技術多樣，代謝物種群繁多，樣本采集和數據分析各有所異，研究樣本量小，尤其是在中醫藥領域未能得到大規模的開展，諸多問題給疾病代謝物數量、種類及代謝途徑的客觀化、具體化、統一化帶來了挑戰。就肺系疾病而言，本文主要探討了“同病異證”導致的代謝差異，只是目前的研究更多集中于動物實驗，西醫臨床診斷、中藥研究等方面涉及病種較少，常見的社區獲得性肺炎、支氣管炎、肺結節等疾病有待補充豐富。相信隨著代謝組學技術的不斷發展和中醫證型、證候規范化，關于中醫證候本質的代謝組學研究將會不斷深化，為疾病的臨床診療提供科學依據。