術前血清MMP-9水平對HBV相關肝細胞癌患者肝切除術后生存的預測作用

高武林，韋超，郭曉燁

(北京市房山區第一醫院 普外科，北京 102400)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第六大常見惡性腫瘤，也是我國癌癥相關死亡的第二大原因[1]。在我國，大約有1億人是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)攜帶者，這與70%～90%的肝癌進展有關[2]。外科手術被認為是HCC最主要的治療方案。但即使是根治性切除，術后仍有較多患者復發或轉移，其遠期生存預后仍不理想[3]。因此，迫切需要尋找評估HBV-HCC治療反應和預后的可靠預測因子。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一個結構上相關但遺傳學不同的含鋅酶家族，參與調節癌細胞生長、分化、凋亡和免疫監控[4]。MMP-9作為一種分泌蛋白酶，可通過促進新血管形成和淋巴管生成加速腫瘤轉移，在癌細胞侵襲、腫瘤轉移和腫瘤血管生成中起重要作用[5]。先前已在不同的惡性腫瘤組織中觀察到MMP-9的過度表達，其過表達通常與不良預后有關[6-7]。但是國內臨床學者對于MMP-9在HBV-HCC患者預后中的作用關注度有限。因此，本研究通過分析術前血清MMP-9與HBV-HCC患者臨床特征的關系，旨在探討術前血清MMP-9對HBV-HCC患者肝切除術后生存的預測作用，為尋找可靠的生物標志物和改進臨床治療策略提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月至2016年11月在我院普外科行根治性肝切除術的868例HBV-HCC患者(HBV-HCC組)的臨床資料，其中男727例，女141例，年齡12～82歲，中位年齡50.0歲。所有患者術前均接受常規評估，包括完整的血液學和血清生化檢查、計算機斷層掃描(CT)和磁共振成像(MRI)掃描。納入標準：HCC的診斷是基于特異性影像學表現，α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)升高≥400 ng·ml-1持續1個月或AFP≥200 ng·ml-1持續2個月，或組織學確認[8]；無肝外轉移證據；HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)檢測陽性；術后經病理檢查無殘余腫瘤及切緣陰性(R0)。排除標準：除乙型肝炎以外的其他傳染病，如丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或艾滋病毒的單一或共同感染；自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、酒精性肝病、脂肪性肝炎、肝移植史；入院前3個月消化道出血和(或)輸血；心肺腎等嚴重功能障礙或其他慢性消耗性疾病；心血管疾病、經頸靜脈肝內門體分流或門靜脈血栓形成。另外納入250例慢性乙型肝炎(CHB)患者作為CHB組。CHB被定義為在登記前至少6個月內HBsAg呈陽性，且沒有肝硬化或肝癌的證據。根據病史、體檢結果、生化、超聲檢查結果診斷為CHB。選擇277例腎功能和肝功能正常，無任何肝病史、飲酒史、心血管疾病或血液疾病史，排除其他急慢性疾病的健康志愿者納入健康對照組。CHB組、健康對照組人群年齡、性別構成與HBV-HCC患者相匹配。該研究得到了本院倫理委員會的批準，并獲得了書面知情同意書。本研究對患者的后續管理沒有影響。

1.2 資料收集

收集所有研究對象的人口統計學和臨床資料，采用日立7600-20全自動生化分析儀測定總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotranseferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，ALB)水平。上述指標的分界值均是根據檢驗科提供的正常參考范圍而設定。術前1周內收集所有血液指標，根據病理報告記錄腫瘤最大直徑、病灶數量、腫瘤Ishak纖維化分期和癌旁組織Ishak炎癥評分，以及肝包膜浸潤情況、分化程度、微血管浸潤和微衛星不穩定情況。

1.3 血清MMP-9檢測

分別在術前及術后隨訪各時間點采集所有受試者清晨空腹靜脈血5 ml于抗凝管中，置于4 ℃環境下，4 000 r·min-1離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存待測。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清MMP-9和AFP水平，試劑盒均購自武漢菲恩生物科技有限公司。所有檢測均由對研究終點不知情的技術人員進行。

1.4 隨訪

最后一次跟進時間是2021年12月31日，或者患者死亡時。術后第1年，每3個月隨訪1次，隨后每3～6個月隨訪1次。每次隨訪由專業醫生獨立進行血液學檢測和肝臟超聲檢查。每6個月進行1次腹部CT掃描。如果懷疑復發，立即進行CT或MRI檢查以確認診斷。確診復發的患者接受進一步治療。如果復發的腫瘤是局限性的，建議進行二次肝切除、射頻消融或經皮乙醇注射。如果復發的腫瘤是多發性或彌漫性的，則進行經導管動脈化療栓塞。治療決定基于復發模式和肝功能儲備。無病生存期(disease-free survival，DFS)定義為手術日期至復發、任何原因死亡或已知患者無病的最后日期之間的時間。總生存期(overall survival，OS)定義為手術日期至隨訪截止時間或死亡時間。

1.5 統計學處理

所有統計數據均使用SPSS 26.0軟件輸入和分析。用中位值(IQR)描述連續變量，3組間比較采用K-W檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney檢驗；二分類變量以率(%)表示，并進行卡方檢驗。繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線以確定血清MMP-9的診斷價值。建立Kaplan-Meier生存曲線，并采用COX回歸比例風險模型分析影響HBV-HCC患者術后生存預后的危險因素。統計學顯著性假設為α=0.05。

2 結 果

2.1 3組受試者血清MMP-9水平比較

與健康對照組[27.82(9.45，41.50)ng·ml-1]比較，CHB組[37.46(13.51，91.24)ng·ml-1]和HBV-HCC組[74.60(46.70，122.08)ng·ml-1]患者血清MMP-9水平均有所升高(H=11.274，P<0.05)，且HBV-HCC組患者基線血清MMP-9水平顯著高于CHB組(Z=-6.081，P<0.05)。經ROC曲線分析，血清MMP-9水平用于區分CHB和HBV-HCC的曲線下面積(AUC)為0.726(95%CI：0.693～0.760)，用于診斷HBV-HCC的AUC為0.773(95%CI：0.742～0.804)，見圖1。

圖1 基線血清MMP-9水平用于區分HBV-HCC和CHB(A)、HBV-HCC和CHB+健康對照(B)的ROC曲線Fig 1 ROC curve of baseline serum MMP-9 level used to distinguish HBV-HCC vs. CHB (A) or HBV-HCC vs. CHB+healthy control (B)

2.2 MMP-9水平與HCC患者不同臨床特征的關系

根據MMP-9水平中位值將患者分為低MMP-9組(<74.60 ng·ml-1)和高MMP-9組(≥74.60 ng·ml-1)。血清MMP-9的表達與患者腫瘤直徑、病灶數量、BCLC分期、HBV-DNA、肝包膜浸潤、分化程度、微血管浸潤、微衛星不穩定有關(P<0.05)，而與患者年齡、性別、AFP、白蛋白-膽紅素(ALBI)評分、白細胞(WBC)、淋巴細胞計數(TLC)、血小板(PLT)、TBIL、ALT、AST、ALB、癌旁組織Ishak炎癥評分、Ishak纖維化均無關(P>0.05)，見表1。

表1 MMP-9水平與HBV-HCC患者不同臨床特征的關系Tab 1 Relationship between MMP-9 level and different clinical features of patients with HBV-HCC

(續表)

2.3 MMP-9水平與HCC患者肝切除術后生存的關系

隨訪期間，高MMP-9組和低MMP-9組術后中位生存時間分別為29、49個月，高MMP-9組1、3、5年OS分別為73.9%(321/434)、44.0%(191/434)、32.9%(143/434)，低MMP-9組1、3、5年OS分別為99.3%(431/434)、85.0%(369/434)、74.9%(325/434)，兩組比較差異有統計學意義(Log Rankχ2=202.610，P<0.001)；高MMP-9組1、3、5年DFS分別為52.7%(229/434)、24.6%(107/434)、8.7%(38/434)，低MMP-9組1、3、5年DFS分別為85.2%(370/434)、58.0%(252/434)、24.6%(107/434)，兩組比較差異有統計學意義(Log Rankχ2=149.134，P<0.001)。見圖2。

圖2 隨訪5年期間Kaplan-Meier曲線Fig 2 Kaplan-Meier curve during 5-year follow-up

2.4 Cox回歸分析

經單因素和多因素Cox回歸比例風險模型分析，術前血清MMP-9、ALBI、AFP、PLT、腫瘤直徑、分化程度、有無微血管浸潤和微衛星不穩定是影響患者OS的獨立危險因素(P<0.05)，術前血清MMP-9水平、腫瘤直徑、病灶數量、HBVDNA、AST、有無微血管浸潤和微衛星不穩定是影響患者DFS的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 單因素和多因素Cox回歸分析影響術后生存預后的危險因素Tab 2 Risk factors influencing postoperative survival prognosis by univariate and multivariate Cox regression analysis

3 討 論

HCC是最常見的惡性腫瘤之一，肝切除術后生存預后較差[1]。HBV感染可促進術后復發，引起過度炎癥，損害殘余肝功能，加重肝切除術后殘肝纖維化，降低HBV-HCC患者肝切除術后的生存率[9]。因此，尋找一些可以預測術后生存預后的潛在標志物將有助于更有針對性的預防治療。本研究結果顯示，HBV感染患者血清MMP-9水平較健康對照人群普遍升高，且HBV-HCC患者較CHB患者升高更明顯，高MMP-9水平是HBV-HCC預后的獨立危險因素，并與疾病進展、HBV DNA拷貝數有關，進一步經ROC曲線證實，血清MMP-9水平可在慢性HBV感染中高度區分HCC和非HCC疾病。此外，血清MMP-9水平升高也與HBV-HCCMMPs主要作為無活性的前蛋白分泌并在被其他細胞外蛋白酶切割后激活，在血管生成、細胞遷移以及一些病理進展(包括癌細胞侵襲和轉移)中發揮作用[4]。MMP-9是Ⅳ型膠原酶，對基底膜具有很高的活性，可降解細胞外基質[10]。研究證實，包含整合的HBV基因組的Hep3B細胞能夠持續分泌HBsAg，并表達HBV基因組RNA，從而促進MMP-9前體分子(proMMP-9)分泌[11]。通過酶譜分析，在Hep3B細胞中可檢測到少量活性MMP-9，而感染HBV的Hep3B細胞中MMP-9表達迅速上調。活性MMP-9表達上調會進一步促進纖溶酶的侵襲潛力[12]，這也部分解釋了HBV感染者血清MMP-9水平升高的原因。此外，從分子機制分析，MMP-9被認為是腫瘤生長和轉移的關鍵調控因子，腫瘤細胞中MMP-9的過表達會增強基底膜的降解，促進附近血管的侵襲，然后向遠處組織外溢形成新的轉移位點[13]。MMP-9是屬于鋅金屬蛋白酶家族的經典酶，參與細胞外基質的降解；而腫瘤的惡性進展通常伴隨細胞外基質的降解[14]，因此HBV-HCC患者血清MMP-9水平較CHB組患者會進一步升高。

患者預后不良相關。這些結果均支持MMP-9參與HBV-HCC的發生和進展，表明血清MMP-9水平的測定不僅對HBV-HCC具有診斷價值，還具有良好的預后預測價值。

目前MMP-9已被證明在人肝癌細胞和各種其他類型的癌癥中分泌，包括肺癌、結腸癌、胃癌和乳腺癌，并與胃癌和胰腺癌患者的不良預后相關[6-7]。在微環境方面，各種基質細胞被迫招募并定位于惡性腫瘤，增強了原發癌的侵襲性，促進了遠處轉移，進而導致患者治療失敗或預后不良[15-16]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)與骨髓來源的抑制細胞相關，是促進腫瘤進展的炎癥的關鍵原型組成部分。實體腫瘤通常被巨噬細胞浸潤。有研究[17]認為MMP-9主要是由TAMs分泌，通過MMP-9/PI3K/AKT/Snail依賴途徑誘導腫瘤上皮向間充質轉化過程，這可能是導致術后腫瘤復發的重要機制之一，而阻斷MMP-9信號的轉導有望成為抑制胃癌術后復發的潛在策略之一。同樣地，Wu等[14]也證實MMP-9的表達主要是由錨定在多形核中性粒細胞表面的CD11b/CD18整合素誘導的，CD11b/CD18則來源于HCC基質M2外顯子。因此即使手術切除腫瘤組織，殘余的TAMs仍可促進MMP-9釋放，MMP-9可以減弱血管和淋巴管的基底膜，使癌細胞直接浸潤到血管系統，參與腫瘤的轉移和侵襲[18]。在之前的對HCC患者研究[19-21]顯示，MMP-9表達已被證明是侵襲性、轉移和預后不良的標志物。這些基礎研究數據均明確證實MMP-9促癌因子的活性，這也從分子機制方面解釋了本研究結果，即術前血清MMP-9水平升高預示著HBV-HCC患者預后不良。另外還需說明的一點，本研究中血清MMP-9水平與AFP無關，且MMP-9對預后的影響也是獨立于AFP的表達，提示血清MMP-9水平有可能作為HBV-HCC(包括AFP陰性HCC)的預后生物標志物。

綜上，本研究表明血清MMP-9水平升高與HBV-HCC的不良預后相關，這點支持了MMP-9參與疾病進展以及血清MMP-9作為HBV-HCC預后生物標志物的可能性。為了證實這些結果，還需要對與各種病因相關的大樣本HCC患者進行研究。