基于數(shù)據(jù)挖掘分析FAM64A在肺腺癌中的表達(dá)模式和作用機(jī)制

龐倩，蒙緒君，肖欽曉

(1.海南博鰲超級醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，海南 瓊海 571437； 2.瓊海市人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，海南 瓊海 571499)

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，具有復(fù)發(fā)率高、早期診斷困難和預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。作為非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer) 的一員，肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD) 占所有肺癌病例的約 40%[2]。目前LUAD的主要治療方式是手術(shù)切除、化療、放療等，但這些治療手段在提高患者生存率方面存在局限性[3-4]。因此，迫切需要探索肺癌的致癌作用和治療方法。靶向治療是目前最有希望的腫瘤治療選擇之一，新型靶向生物標(biāo)志物的探索是LUAD研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)。

FAM64A (family with sequence similarity 64 member A)定位于19號染色體，具有10個外顯子區(qū)域，主要分布于胸腺、脾臟和結(jié)腸中[5]。早期研究發(fā)現(xiàn)FAM64A 可以控制細(xì)胞分裂過程中中期到后期的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞增殖，顯示了其在癌細(xì)胞生長中的作用[6]。有研究人員發(fā)現(xiàn)FAM64A蛋白在淋巴瘤、白血病等血液系統(tǒng)腫瘤中高度表達(dá)[7]。其次，Jiang等[8]已經(jīng)證明 FAM64A 可以通過激活 NF-κB 信號來促進(jìn)乳腺癌的侵襲性。此外，Jiao等[9]報道高表達(dá)FAM64A可被視為胰腺癌預(yù)后較差的獨(dú)立危險因素。Jiang等[10]證實(shí)，F(xiàn)AM64A可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的侵襲性發(fā)育。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中FAM64A的表達(dá)高于正常腦組織，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)FAM64A的過表達(dá)增加了細(xì)胞周期蛋白 D1、細(xì)胞周期蛋白 E、波形蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)-2 和 MMP-9 的表達(dá)，但降低了 E-鈣黏蛋白的表達(dá)。盡管相關(guān)研究顯示了FAM64A在癌癥發(fā)生發(fā)展中的潛力，但尚未見報道其在LUAD中的表達(dá)、預(yù)后和潛在的作用機(jī)制。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和生物學(xué)信息方法的應(yīng)用，我們可以對現(xiàn)有的公開可獲取的腫瘤學(xué)數(shù)據(jù)資源進(jìn)行二次挖掘，以探索FAM64A在LUAD中的表達(dá)和作用機(jī)制，希望能為后續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TIMER數(shù)據(jù)庫

TIMER網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器是一個用戶友好的數(shù)據(jù)平臺，可用于系統(tǒng)地分析不同類型癌癥的免疫細(xì)胞浸潤。此外，TIMER網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器允許用戶輸入特定功能的參數(shù)，并動態(tài)顯示所得到的數(shù)字，以方便獲取腫瘤的免疫學(xué)、臨床和基因組學(xué)特征[12]。本研究利用TIMER數(shù)據(jù)庫的“Diff Exp”模塊探索FAM64A在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)差異。

1.2 基因表達(dá)譜交互式分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫

GEPIA數(shù)據(jù)庫含來自TCGA 和 GTEx 項目的9 736個腫 瘤和8 587個正常樣本的 RNA 測序表達(dá)數(shù)據(jù)[13]。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫的“Expression DIY”模塊分析FAM64A在LUAD中的表達(dá)以及FAM64A表達(dá)與LUAD臨床分期的相關(guān)性。

1.3 UALCAN數(shù)據(jù)庫

UALCAN 是一個綜合的、用戶友好的、交互式的網(wǎng)絡(luò)資源，用于分析癌癥 OMICS 數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)庫旨在提供對公開可用的癌癥 OMICS 數(shù)據(jù)(TCGA、MET500 和 CPTAC)的訪問和分析[14]。本研究利用UALCAN數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析FAM64A表達(dá)與LUAD臨床分期的相關(guān)性。

1.4 Kaplan-Meier Plotter

使用在線數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier Plotter評估FAM64A在LUAD中的預(yù)后預(yù)測價值，該數(shù)據(jù)包含基因表達(dá)數(shù)據(jù)和多種人類惡性腫瘤患者的生存數(shù)據(jù)[15]。為了分析LUAD的OS、RFS，我們將患者樣本按最佳截取值分成高表達(dá)和低表達(dá)組，利用 Kaplan-Meier Plotter生成生存曲線以分析FAM64A在LUAD中的預(yù)后預(yù)測意義。

1.5 cBioPortal數(shù)據(jù)庫

cBioPortal(www.cbioportal.org)是一個全面的網(wǎng)絡(luò)資源，可以可視化和分析多維的癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)[16]。本研究基于TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集，從cBioPortal獲得了FAM64A的基因改變類型和和突變頻率。

1.6 相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

GeneMANIA (http:∥genemania.org) 是一個開放的、用戶友好的在線數(shù)據(jù)庫，在該數(shù)據(jù)庫中提交一個基因， GeneMANIA會使用大量基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)查找功能相似的基因并生成基因互作網(wǎng)絡(luò)圖[17]。STRING 數(shù)據(jù)庫旨在收集、評分和整合所有公開可用的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息來源，并通過計算預(yù)測來補(bǔ)充這些信息。其目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)一個全面客觀的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[18]。本研究分別利用GEMEMANIA和STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建FAM64A的基因互作網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。韋恩圖在線工具(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)用于獲取兩個網(wǎng)絡(luò)中的交集基因。

1.7 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫

LinkedOmics數(shù)據(jù)庫是一個基于網(wǎng)絡(luò)的平臺，可用于分析32個TCGA癌癥相關(guān)的多維數(shù)據(jù)集[19]。本研究中，F(xiàn)AM64A的共表達(dá)使用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以火山圖和熱圖的形式呈現(xiàn)。使用LinkedOmics的功能模塊并通過基因集富集分析(GSEA)對共表達(dá)基因所參與的KEGG通路進(jìn)行探索，設(shè)置參數(shù)為FDR<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 FAM64A在LUAD中顯著高表達(dá)

TIMER數(shù)據(jù)庫分析顯示，與正常組織相比，F(xiàn)AM64A在膀胱癌、乳腺癌、膽管癌、結(jié)直腸癌、食管癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、LUAD、肺鱗癌、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌和子宮內(nèi)膜癌中顯著高表達(dá)(圖1A)。GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析顯示，與正常組織相比，F(xiàn)AM64A在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、食管癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、低級別膠質(zhì)瘤、LUAD、肺鱗癌、卵巢癌、胰腺癌、皮膚黑色素瘤、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、子宮內(nèi)膜癌和子宮肉瘤顯著高表達(dá)(圖1B)。圖1C表達(dá)柱狀圖顯示，與正常肺組織相比，F(xiàn)AM64A在LUAD中顯著高表達(dá)。

A.與正常組織相比，F(xiàn)AM64A在多數(shù)惡性腫瘤組織中顯著高表達(dá)(TIMER數(shù)據(jù)庫)；B. 與正常組織相比，F(xiàn)AM64A在多數(shù)惡性腫瘤組織中顯著高表達(dá)(GEPIA數(shù)據(jù)庫)；C.與正常組織相比，F(xiàn)AM64A在LUAD中顯著高表達(dá)(GEPIA數(shù)據(jù)庫)圖1 FAM6A4在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異A.Compared with normal tissues, FAM64A was significantly higher in most malignant tumor tissues (TIMER database); B. Compared with normal tissues, FAM64A was significantly high expression in most malignant tumor tissues(GEPIA database); C. Compared with normal tissue, FAM64A was significantly high expression in lung adenocarcinoma (GEPIA database)Fig 1 The expression difference of FAM6A4 in tumor tissues and normal tissues

2.2 FAM64A表達(dá)與LUAD臨床分期以及預(yù)后的關(guān)系

為了分析FAM64A在LUAD中的臨床意義，我們利用GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫探索FAM64A表達(dá)與LUAD臨床分期的關(guān)系，結(jié)果如圖2A、B所示，隨著FAM64A表達(dá)量的升高，LUAD分期越晚。此外，我們還分析FAM64A表達(dá)對LUAD患者的預(yù)后影響，通過Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫繪制了生存曲線以評估FAM64A對LUAD患者5年總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率的影響。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM64A高表達(dá)組患者的總體生存率明顯低于低表達(dá)組患者(圖2C)。此外，F(xiàn)AM64A高表達(dá)組患者同樣表現(xiàn)出了較差的無復(fù)發(fā)生存率(圖2D)。以上研究結(jié)果提示，F(xiàn)AM64A高表達(dá)與LUAD患著的不良臨床結(jié)局有關(guān)。

A、B.FAM64A表達(dá)越高，LUAD患者的臨床分期越晚；C、D.與FAM64A低表達(dá)組LUAD患者相比，高表達(dá)組患者的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率明顯較低圖2 FAM6A4高表達(dá)在LUAD中的臨床意義A、B. The higher the FAM64A expression, the later the clinical stage of lung adenocarcinoma patients; C、D. The overall survival and recurrence-free survival rates of patients in the high expression group were significantly worse compared to those in the low FAM64A expression group of lung adenocarcinoma patientsFig 2 The clinical significance of FAM6A4 lung adenocarcinoma

2.3 FAM64A在LUAD中的遺傳突變分析

為了研究FAM64A在LUAD中異常表達(dá)的原因，我們從遺傳突變和基因甲基化方面進(jìn)行探索。首先cBioPortal數(shù)據(jù)庫顯示，F(xiàn)AM64A在LUAD中發(fā)生了7.39%的突變(圖3A)，其中包括mRNA High(5.65%)和Deep Deletion(1.74%)兩種突變類型(圖3B)。接著我們評估了突變組和非突變組之間的總體生存率，結(jié)果顯示兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3C)。

A.FAM64A在LUAD中的遺傳突變頻率為7.39%；B.FAM64A在LUAD中的兩種突變類型分別為mRNA High(5.65%)和Deep Deletion(1.74%)；C.生存分析顯示，突變組和非突變組之間總體生存率未見差異圖3 FAM6A4在LUAD中的遺傳突變A. The genetic mutation frequency of FAM64A in lung adenocarcinoma is 7.39%; B. The two mutation types of FAM64A in lung adenocarcinoma are mRNA High (5.65%) and Deep Deletion (1.74%); C. Survival analysis showed that there was no difference in overall survival between the mutant group and the non-mutant groupFig 3 Genetic mutations of FAM6A4 in lung adenocarcinoma

2.4 FAM64A基因互作網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用GEMEMANIA和STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了FAM64A的基因和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)在基因水平FAM64A主要與PICALM、TDRD7、RBBP7、RBBP4、MTA2、HDAC2、SAPCD2、KIF15、CDT1、HDAC1、PRNP、PHF19、TYMS、ZYG11B、CCNE1、BUB1、UBASH3B、SPC24、BLM和TACC3存在相互聯(lián)系(圖4A)。而在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中，F(xiàn)AM64A主要與ASPM、AURKB、BIRC5、BUB1、CCNA2、CCNB2、CDC20、CDCA8、CENPA、CENPF、CEP55、DLGAP5、HJURP、KIF20A、KIF2C、NCAPG、SPAG5、TPX2、TROAP和UBE2C存在相互聯(lián)系(圖4B)。取以上相互作用網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的交集發(fā)現(xiàn)，在基因互作網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中FAM64A均與BUB1存在相互作用(圖4C)。

A.FAM64A基因互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建；B.FAM64A蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建；C.韋恩圖顯示FAM64A可能與BUB1存在相互作用關(guān)系圖4 FAM64A相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建A.Construction of FAM64A gene interaction network；B.Construction of the FAM64A protein interaction network；C. Venn diagram showed that FAM64A might interact with BUBFig 4 Construction of FAM64A interaction network

2.5 FAM64A的共表達(dá)分析和功能富集分析

本研究利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫的LinkFinder模塊用于獲取FAM64A的相關(guān)性基因，結(jié)果顯示有7 139個基因與FAM64A存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，有6 233個基因與FAM64A存在正相關(guān)關(guān)系(圖5A)。圖5B、C分別顯示與FAM64A存在正、負(fù)相關(guān)關(guān)系的前50個基因。其次，我們利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫的Linkinterpreter模塊分析FAM64A及其相關(guān)基因可能參與的信號通路，結(jié)果如圖5D所示，F(xiàn)AM64A及其相關(guān)基因主要參與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、同源重組、P53信號通路、氧化磷酸化等信號通路。

A.共表達(dá)基因火山圖；B、C.與FAM64A存在正、負(fù)相關(guān)的前50個基因；D.FAM64A及其共表達(dá)基因的京都基因與基因組百科全書圖5 FAM64A在LUAD中的共表達(dá)分析和功能富集分析A.Volcano map of co-expressed genes; B-C. The top 50 genes that are positively and negatively related to FAM64A; D. Kyoto Gene and Genome Encyclopedia for FAM64A and its co-expressed genesFig 5 Co-expression analysis and functional enrichment analysis of FAM64A in lung adenocarcinoma

3 討 論

肺癌是人類的主要死因，其中，LUAD是肺癌最常見的亞型。盡管包括免疫療法、放射療法和無創(chuàng)手術(shù)切除在內(nèi)的多模式治療策略在近幾十年來取得了很大進(jìn)展，但LUAD患者的臨床結(jié)局仍然不盡如人意，5年相對總體生存率僅為18%[1,4]?；诮陙硇屡d的“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”概念，分子病理學(xué)檢測方法和靶向治療的改進(jìn)顯著提高了LUAD患者的總生存期[20-21]。然而，由于跨越一系列不同生物學(xué)和臨床行為的不利因素的組合以及對抗肺癌藥物的耐藥性的增加，現(xiàn)有的靶向藥物顯示出不令人滿意的療效[22-23]。因此，有必要為LUAD患者的分子病理學(xué)診斷和預(yù)后預(yù)測尋找更有效的指標(biāo)。本研究基于數(shù)據(jù)挖掘探討FAM64A作為LUAD靶向生物標(biāo)志物的可能性，希望能為后續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

本研究中我們分析了 FAM64A在人類惡性腫瘤的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAM6A4在包括LUAD在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤中顯著高表達(dá)；其次我們發(fā)現(xiàn)FAM64A高表達(dá)與LUAD患者的不良臨床結(jié)局有關(guān)，F(xiàn)AM64A表達(dá)水平越高，患者分期越晚、預(yù)后越差。這些研究結(jié)果提示FAM64A在LUAD中可能充當(dāng)癌基因的角色。接著本研究試圖從遺傳學(xué)角度分析FAM64A突變在LUAD中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAM64A僅僅在少數(shù)LUAD患者中發(fā)生遺傳突變，且突變組和非突變組之間并未發(fā)現(xiàn)生存差異。提示遺傳突變可能不是FAM64A在LUAD中高表達(dá)的原因。然后我們在基因水平和蛋白水平分別構(gòu)建了FAM64A的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)FAM64A可能與BUB1存在功能聯(lián)系。多域蛋白激酶 BUB1是紡錘體組裝有絲分裂檢查點(diǎn)的核心組成部分,在控制細(xì)胞染色體分離中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[24]。Zhu等[25]報道BUB1可通過激活SMAD2磷酸化進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。Piao等[26]發(fā)現(xiàn)BUB1高表達(dá)預(yù)示胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后不良。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)AM64A可能與BUB1相互作用進(jìn)而促進(jìn)LUAD的發(fā)生發(fā)展。最后，我們獲取了FAM64A的共表達(dá)基因并對其進(jìn)行功能分析，以探索FAM64A在LUAD中的潛在作用機(jī)制。結(jié)果顯示FAM64A及其相關(guān)基因參與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、同源重組、P53信號通路、氧化磷酸化等信號通路。這些信號通路在癌癥進(jìn)展中的作用早已得到廣泛證實(shí)。例如，DNA 復(fù)制確保細(xì)胞遺傳信息被準(zhǔn)確復(fù)制并正確傳遞給后代細(xì)胞。然而，DNA復(fù)制在體內(nèi)各種壓力下容易受到干擾和破壞，導(dǎo)致DNA復(fù)制停滯，影響基因組穩(wěn)定性，甚至誘發(fā)細(xì)胞凋亡、壞死和癌變[27-28]。p53是一種與DNA特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。它可以調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期暫停、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡[29-30]。因此，上述結(jié)果表明FAM64A通過上述信號通路促進(jìn)LUAD發(fā)生發(fā)展并導(dǎo)致LUAD患者的生存率降低，即FAM64A具有作為LUAD新型治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物的潛能。

然而，我們的研究仍然存在一些局限性。首先，本研究是一項回顧性研究，樣本量較少，分析偏倚無法避免。其次，本研究缺乏FAM64A在LUAD中的蛋白組學(xué)證據(jù)，未能在蛋白質(zhì)水平證實(shí)FAM64A在LUAD中的表達(dá)。此外，本研究所得結(jié)果均來自公開數(shù)據(jù)庫，應(yīng)通過基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí) FAM64A在LUAD中的表達(dá)、臨床意義以及潛在的調(diào)控機(jī)制。