2種韭菜揮發(fā)性成分對植物病原真菌和斜紋夜蛾幼蟲生長的影響

謝 諾，馮少平，李珊珊，曾任森，陳 平，李永泉，張 暉*

(1.臺山市紅嶺種子園，廣東臺山 529000；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州 510225；3.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002)

韭菜是一種原產(chǎn)我國的百合科蔥屬植物，國外學(xué)者對蔥屬植物研究較多[1-2]，但韭菜研究相對少，一方面是韭菜主要分布在東南亞，另一方面韭菜的研究多數(shù)從食品角度來分析，并沒有深入地研究具體化合物在抑菌方面的作用。硫醚類物質(zhì)在自然界中廣泛存在，具有一定的抗菌活性。如二甲基二硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、2-甲基-2-戊烯醛等存在于大蒜和洋蔥中[3-4]；二甲基硫醚、二甲基三硫醚等存在于韭菜[5]和荔枝中[6-7]。

研究顯示二甲基二硫醚具有生物防除甘藍(lán)地種蠅(Deliaradicum)的潛在能力[8]。蔥屬中的抗菌活性物質(zhì)主要是硫代亞磺酸酯和其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物如各類硫化物[9-10]。其次是一些縮氨酸[11]、黃酮類化物[12]、酚類和生物堿[13]。蔥屬中硫代亞磺酸酯已被證明具有抗各種細(xì)菌和真菌的作用[2，14]。韭菜根和葉蒸餾油含有多種硫醚類化合物，筆者在原有研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛的抑菌能力和對斜紋夜蛾幼蟲生長的影響，以此評估韭菜揮發(fā)性成分在農(nóng)業(yè)病蟲害防治上的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物病原菌菌種。用作測定韭菜揮發(fā)物抗菌活性的植物病原菌包括番茄早疫病菌(Alternariasolani)、香蕉炭疽病菌(GloeosporiummusarumCooke et Mass)、玉米紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)、荔枝炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、青瓜枯萎病菌(Fusarium.oxysporiumf.sp.cucumarinum)、小麥赤霉病菌(Gibberellazeae(Schew.)Retch)、荔枝霜疫霉病菌(PenorophythoralitchiChen)。

1.1.2韭菜揮發(fā)物中的化合物標(biāo)準(zhǔn)品。二甲基三硫醚(dimethyl trisulfide)、2-甲基-2-戊烯醛(2-methyl-2-pentenal)等標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1菌種培養(yǎng)。培養(yǎng)植物病原菌的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，接種病原菌后在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d待菌落長滿培養(yǎng)皿備用。

1.2.2FOC孢子平板。FOC在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，用無菌水經(jīng)3層紗布過濾洗脫孢子，經(jīng)無菌水稀釋得孢子液，濃度約103個/mL，同時用平板檢測方法檢測其實際孢子可萌發(fā)數(shù)。吸取0.2 mL孢子液于PDA培養(yǎng)皿中進(jìn)行涂板。

1.2.3抑菌能力比較。將“1.2.2”培養(yǎng)好的菌株平板用0.5 cm打孔器打出菌落塊接于直徑7 cm的PDA平板中間，將4個已接菌塊的平板放入高12.5 cm、上底直徑22 cm、下底直徑 19 cm、總?cè)莘e4 L的玻璃水槽中，分別吸取100、200、300 μL的二甲基三硫醚(dimethyl trisulfide)和2-甲基-2-戊烯醛(2-methyl-2-pentenal)放入水槽中央，即最終濃度為25、50、75 μL/L，并立即蓋上3層保鮮膜，用橡筋箍緊。以不添加揮發(fā)物作為對照，并在對照處理菌塊生長滿培養(yǎng)皿時計算各處理的抑菌率。每個水槽放4個接有菌塊的培養(yǎng)基，每個處理設(shè)置3個水槽。試驗操作過程需在超凈工作臺中進(jìn)行。

1.2.4對斜紋夜蛾幼蟲生長的影響。分別吸取二甲基三硫醚(dimethyl trisulfide)和2-甲基-2-戊烯醛(2-methyl-2-pentenal)10 μL于棉花中，并將棉花分別放入10 L水槽中央，即濃度為1 μL/L。同時，將裝有3齡斜紋夜蛾幼蟲的果凍杯一同置于水槽中，果凍杯中放入斜紋夜蛾飼料，每個水槽放5條幼蟲，每個處理組4個重復(fù)。水槽口用3層保鮮膜蓋上，用橡筋箍緊，以不放揮發(fā)物的處理為對照組。分別對幼蟲進(jìn)行稱重，共觀察5 d，并計算其較初始重的增重比。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用WPS 2022進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的整理，利用SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和顯著性檢驗。所有顯著性水平均設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 對番茄早疫病病原菌的抑制作用二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對番茄早疫病病原菌的生長抑制結(jié)果見圖1。由圖1可知，在濃度為25 μL/L，二甲基三硫醚對番茄早疫病病原菌的生長抑制率達(dá)94%，2-甲基-2-戊烯醛此濃度下的抑制率只有54%。當(dāng)濃度增加到50 μL/L，二甲基三硫醚對番茄早疫病病原菌的生長抑制率已達(dá)100%，2-甲基-2-戊烯醛的抑制率為90%。2個化合物在濃度為75 μL/L已經(jīng)完全抑制番茄早疫病病原菌的生長。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level圖1 二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對番茄早疫病病原菌菌落生長的影響Fig.1 Effects of dimethyl trisulfide and 2-methyl-2-pentenal on colony growth of Alternaria solani

2.2 對香蕉炭疽病病原菌的抑制作用二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對香蕉炭疽病病原菌的生長抑制結(jié)果見圖2。由圖2可知，在濃度為25 μL/L，二甲基三硫醚對香蕉炭疽病病原菌的生長抑制率為62%，此濃度下2-甲基-2-戊烯醛的抑制率為49%。當(dāng)濃度增加到50 μL/L，2-甲基-2-戊烯醛的抑制率提高到72%，二甲基三硫醚已經(jīng)完全抑制香蕉炭疽病病原菌的生長，而2-甲基-2-戊烯醛濃度在75 μL/L下的抑制率為75%。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level圖2 二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對香蕉炭疽病病原菌菌落生長的影響Fig.2 Effects of dimethyl trisulfide and 2-methyl-2-pentenal on colony growth of Gloeosporium musarum Cooke

2.3 對玉米紋枯病病原菌的抑制作用由于玉米紋枯病病原菌在對照中的生長速度很快，試驗進(jìn)行第3天對照已經(jīng)完全長滿玉米紋枯病，所以圖3的結(jié)果是試驗第3天的結(jié)果，二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛在濃度為50 μL/L時已經(jīng)完全抑制玉米紋枯病病原菌的生長，在濃度25 μL/L，二甲基三硫醚的抑制率為100%，2-甲基-2-戊烯醛則為73%，二甲基三硫醚具有比2-甲基-2-戊烯醛更高的抑菌能力。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level圖3 二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對玉米紋枯病病原菌菌落生長的影響Fig.3 Effects of dimethyl trisulfide and 2-methyl-2-pentenal on colony growth of Rhizoctonia solani Kühn

2.4 對青瓜枯萎病病原菌的抑制作用從圖4可以看出，在濃度為25 μL/L，二甲基三硫醚的抑制率為91%，2-甲基-2-戊烯醛只有10%。當(dāng)濃度升至50 μL/L，二甲基三硫醚已經(jīng)完全抑制病原菌的生長，而2-甲基-2-戊烯醛的抑制率從25 μL/L的10%升至50 μL/L 的34%，2-甲基-2-戊烯醛濃度為75 μL/L的抑制率為49%。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level圖4 二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對青瓜枯萎病病原菌菌落生長的影響Fig.4 Effects of dimethyl trisulfide and 2-methyl-2-pentenal on colony growth of Fusarium.oxysporium f.sp.cucumarinum Owen

2.5 對小麥赤霉病病原菌的抑制作用二甲基三硫醚對小麥赤霉病病原菌在濃度25 μL/L的抑制率為51%，2-甲基-2-戊烯醛在此濃度的抑制率只有二甲基三硫醚的約50%，抑制率為25%。二甲基三硫醚在濃度50 μL/L的抑菌率為83%，在75 μL/L已經(jīng)完全抑制小麥赤霉病病原菌菌落的生長，2-甲基-2-戊烯醛在濃度75 μL/L的抑制率從50 μL/L的55%上升到63%(圖5)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level圖5 韭菜揮發(fā)物二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對小麥赤霉病病原菌菌落生長的影響Fig.5 Effects of dimethyl trisulfide and 2-methyl-2-pentenal on colony growth of Gibberella zeae (Schew.)Retch

2.6 對荔枝霜疫霉病病原菌的抑制作用二甲基三硫醚對荔枝霜疫霉病病原菌菌落生長的抑制能力比2-甲基-2-戊烯醛高(圖6)，同濃度下2個化合物差異顯著。濃度在25 μL/L，二甲基三硫醚的抑菌率為63%，2-甲基-2-戊烯醛為14%，后者只有前者的22%。二甲基三硫醚在濃度為75 μL/L已經(jīng)完全抑制病原菌菌落的生長，此時2-甲基-2-戊烯醛的抑菌率為40%，僅比其在50 μL/L時的抑菌率提高了11%。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level圖6 二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對荔枝霜疫霉病病原菌菌落生長的影響Fig.6 Effects of dimethyl trisulfide and 2-methyl-2-pentenal on colony growth of Penorophythora litchi Chen

2.7 對荔枝炭疽病病原菌的抑制作用二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對荔枝炭疽病菌的抑制作用比較，二甲基三硫醚在濃度25 μL/L時抑菌率為50%，此濃度下2-甲基-2-戊烯醛的抑菌率僅為28%，為二甲基三硫醚的56%。當(dāng)濃度升至50 μL/L，二甲基三硫醚對荔枝炭疽病病原菌抑菌率已達(dá)67%，2-甲基-2-戊烯醛在此濃度的抑菌率為42%，與二甲基三硫醚差異顯著，濃度為75 μL/L時，二甲基三硫醚的抑菌率為80%，2-甲基-2-戊烯醛的抑菌率為54%(圖7)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level圖7 二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對荔枝炭疽病病原菌菌落生長的影響Fig.7 Effects of dimethyl trisulfide and 2-methyl-2-pentenal on colony growth of Colletotrichum gloeosporioides

2.8 對斜紋夜蛾幼蟲生長的影響在1 μL/L濃度下，二甲基三硫醚使斜紋夜蛾三齡幼蟲無法繼續(xù)生長(圖8)，死亡率為100%，而2-甲基-2-戊烯醛對幼蟲生長的影響第1天和第2天時，差異顯著，對照組的增重比分別為96%和553%，而2-甲基-2-戊烯醛處理組的增重比分別為199%和467%。但從第3天開始，2-甲基-2-戊烯醛處理組與對照組之間差異不顯著，說明此濃度下斜紋夜蛾幼蟲仍能正常的取食和生長。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level圖8 二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對斜紋夜蛾幼蟲生長的影響Fig.8 Effects of dimethyl trisulfide and 2-methyl-2-pentenal on growth of Spodoptera litura larva

針對二甲基三硫醚在1 μL/L濃度下斜紋夜蛾幼蟲死亡現(xiàn)象，將濃度設(shè)置為0.02和0.10 μL/L。由圖9可知，在處理1 d后，對照的增重比為78%，0.02 μL/L處理組的增重比為98%，0.10 μL/L處理組的增重比為80%，但處理組與對照組幼蟲的增重比差異不顯著。從第2天開始，處理組幼蟲的增重比與對照組之間差異顯著，對照組在第2天的增重比為424%，而處理組0.02 μL/L下增重比為188%，0.10 μL/L則為210%，2個處理組之間差異不顯著。到第5天，對照組的增重比已達(dá)3 312%，而此時0.02 μL/L的增重比為2 125%，0.10 μL/L增重比為1 465%。0.02 μL/L濃度對斜紋夜蛾幼蟲的生長具有顯著的抑制作用。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level圖9 二甲基三硫醚和2-甲基-2-戊烯醛對斜紋夜蛾幼蟲生長的影響Fig.9 Effects of dimethyl trisulfide on larva growth of Spodoptera litura

3 結(jié)論與討論

從總體效果來看，二甲基三硫醚的抑菌效果最好，在濃度為50 μL/L時，番茄早疫病、香蕉炭疽病、玉米紋枯病、青瓜枯萎病病原菌菌塊已無法生長，抑制率為100%；在濃度為75 μL/L時，小麥赤霉病和荔枝霜霉病的病原菌菌塊也已無法正常生長。在7種病原菌中，玉米紋枯病病原菌的致死濃度最低，為25 μL/L。在設(shè)置的3個濃度中，2-甲基-2-戊烯醛只有在75 μL/L下對番茄早疫病和玉米紋枯病病原真菌起到完全生長抑制作用，此濃度下對香蕉炭疽病、荔枝炭疽病、青瓜枯萎病、小麥赤霉病和荔枝霜霉病病原菌塊的抑制率分別為75%、54%、49%、64%和40%，其抑制率均遠(yuǎn)低于同濃度下二甲基三硫醚的抑制效果。

研究發(fā)現(xiàn)，相同濃度下，二甲基三硫醚對香蕉枯萎病4號小種的抑制作用低于2-甲基-2-戊烯醛的作用[5]。韭菜代謝產(chǎn)物2-甲基-2-戊烯醛的衍生物SA對香蕉枯萎病鐮刀菌4號生理小種的抑制作用在600 μL/L時對FOC的抑菌率為100%。

與病原真菌抑制效果相似，2種化合物對斜紋夜蛾幼蟲的抑制中二甲基三硫醚的生長抑制效果最好，在濃度為1 μL/L時，斜紋夜蛾幼蟲已致死，而此時2-甲基-2-戊烯醛對幼蟲生長的影響與對照相比差異不顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，即使在濃度為0.02 μL/L下，斜紋夜蛾幼蟲也已無法正常生長，增重比顯著低于對照組，而在0.10 μL/L濃度下，其對斜紋夜蛾幼蟲生長的影響與0.02 μL/L下差異不顯著。研究表明，韭菜揮發(fā)油和吡嗪類化合物是通過小菜蛾觸角對其產(chǎn)生電位響應(yīng)，從而表現(xiàn)出較為明顯的趨避活性，提取物均可抑制2種重要解毒酶GSTs和 CarE的活性[15]。

從2個化合物的沸點來看，二甲基三硫醚的沸點只有50 ℃，2-甲基-2-戊烯醛沸點高于100 ℃，2種化合物的揮發(fā)成分中二甲基三硫醚要高很多，這使得在密閉環(huán)境中化合物的有效濃度有差異。而揮發(fā)性的強弱，也會直接影響植物的驅(qū)避作用，研究發(fā)現(xiàn)韭菜提取物對植物病原真菌[16]和病原細(xì)菌、食品污染菌如鮑曼不動桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等均有明顯的抑制作用[17]。且其中的苯丙酸類物質(zhì)具有明顯的抗凝血效果[18]。在農(nóng)業(yè)中可以通過植物間作來驅(qū)避病蟲害的發(fā)生[19-20]，同時，通過不同品種韭菜提取物的抑菌活性差異性[7]，篩選適合的間作品種以及制成植物源殺蟲劑和病原菌抑制劑具有很好的應(yīng)用前景。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，在更好地開展糧食種植的基礎(chǔ)上，如何通過植物特性和模式種植以提高病蟲害防治將是未來農(nóng)業(yè)生態(tài)建設(shè)的趨勢。