浙貝母黑斑病病原菌生物學特性研究

何曉嬋,李 玲,周小軍,龍安琪,李 強,路子琪,朱麗燕*

(1.金華市農業科學研究院，浙江金華 321000；2.浙江農林大學，浙江臨安 311300 )

浙貝母(FritillariathunbergiiMiq.)又稱大貝、元寶貝、象貝，是百合科多年生草本植物，為常用大宗中藥材和“浙八味”之一，在浙江、江西、湖南等省份均有大面積栽培[1]。浙江的主產區主要包括鄞州、磐安、縉云等地，種植面積約3 670 hm2，占全國的90%以上，是當地農民的主要收入來源[2-4]。

近年來，隨著種植面積的不斷擴大，加上藥農盲目引種，導致浙貝母病害日益突出且呈現多樣化，嚴重影響了浙貝母的產量和質量[5-7]。其中黑斑病是浙貝母的重要病害之一，在田間常與灰霉病混合發生，主要危害葉片，葉片感病后從葉尖開始發病，葉色變淡，呈水漬狀褐色病斑，病部與健部有明顯的界限，接近健部有暈圈。此病由真菌半知菌亞門交鏈孢菌(Alternariaalternate(Friss.) Keissler)侵染所致[8]。在浙江常年于3月下旬開始發病，直至植株地上部分枯死。如遇清明節前后春雨連綿，病害則會加重。一般多雨年份有利于該病害的發生[6]。

關于浙貝母黑斑病的發生、防治已有少量報道，但對其病原菌生物學特性研究未見相關文獻。筆者對浙貝母黑斑病病原菌生物學特性進行了系統性研究，以期為病害深入研究及其防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料2020年3月，浙貝母黑斑病樣本采自浙江省金華市農業科學研究院基地，供試菌株由浙貝母黑斑病樣本中分離純化獲得，并經浙江農林大學真菌-植物互作實驗室準確鑒定并保存。在試驗前，轉移到直徑為90 mm的PDA培養基平板中間，20 ℃活化培養得到試驗用菌株。

1.2 試驗方法

1.2.1生長測定。將直徑5 mm 的浙貝母黑斑病病原菌菌餅接種于 PDA 平板中央，置于特定條件下培養，數天后采用十字交叉法測量菌落直徑，設6次重復，取平均值。

1.2.2不同光照對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響。共設完全光照(光照∶黑暗=24 L∶0 D)、光暗交替(光照∶黑暗=12 L∶12 D)和完全黑暗(光照∶黑暗=0 ∶24 D)3個處理，在PDA培養基上接入直徑5 mm的菌絲塊，每個處理6次重復，分別置于不同光照條件下培養，測定方法同“1.2.1”。

1.2.3不同溫度對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響。將直徑5 mm的供試菌株菌絲塊接種于PDA平板上，分別置于7、22、25、28、30和33 ℃條件下培養，每個處理設6次重復。測定方法同“1.2.1”。

1.2.4不同pH對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響。將配制好未添加瓊脂的PDA培養基分裝到10個三角瓶中，每瓶量取150 mL，用1 mmol/L HCl和5 mmol/L NaOH將其pH分別調成4、5、6、7、8、9、10、11，按50∶1的比例加入瓊脂。再放至滅菌鍋中高溫高壓滅菌，將滅菌后的培養基倒板，每個處理設6次重復。將直徑5 mm的菌絲塊接入到上述倒好的平板中，置于26 ℃條件下培養，測定方法同“1.2.1”。

1.2.5不同碳氮源對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響。基礎培養基為Czapek，其碳源為蔗糖，1 L Czapek培養基中含30 g蔗糖，以等重量的果糖、木糖、葡萄糖、纖維素、麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉分別置換基礎培養基中的蔗糖，以制備不同碳源的培養基。以等重量的甘氨酸、牛肉浸膏、胰蛋白胨、硫酸銨、尿素、氯化銨、脯氨酸分別置換基礎培養基中的硝酸鈉，以制備不同氮源的培養基。將配制好的培養基高溫高壓滅菌后，倒平板，每個處理設6次重復，將直徑5 mm的菌絲塊接入到上述倒好的平板中，置于26 ℃下培養。測定方法同“1.2.1”。

2 結果與分析

2.1 不同光照對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響光照對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響見圖1。由圖1可知，在12 h光暗交替處理、24 h連續黑暗、24 h連續光照條件下的菌落直徑分別為6.90、6.31、7.08 cm，則按照直徑從小到大表現為全黑暗<12 h光暗交替處理<全光照，由此可知，全光照處理的菌落直徑顯著大于黑暗處理，12 h光暗交替處理與24 h連續黑暗、24 h連續光照差異不顯著(圖2)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)圖1 不同光照對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.1 Effects of different photoperiods on mycelium growth of Alternaria alternate(Friss.) Keissler

圖2 不同光照對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響(正、反)Fig.2 Effects of different photoperiods on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

2.2 不同溫度對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響溫度對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響見圖3。由圖3可知，溫度對病原菌菌絲生長有顯著影響。浙貝母黑斑病病菌對溫度的適應范圍較廣，病原菌菌絲在7～33 ℃條件下均能生長。在22～30 ℃條件下，病原菌菌絲生長良好。該菌落的最適生長溫度為25 ℃，其次為28 ℃，平均菌落直徑分別為5.17和4.87 cm，當溫度高于30 ℃時，菌落生長速率明顯下降(圖4)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)圖3 不同溫度對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.3 Effects of different temperatures on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

圖4 不同溫度對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.4 Effects of different temperatures on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

2.3 不同pH對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響由圖5可知，浙貝母黑斑病病菌對酸堿度適應范圍較廣，病原菌在pH 4～11時均能生長。在相同的培養時間內，pH為7時該菌的菌落直徑最大，為4.80 cm，顯著高于其他pH處理，表明該菌生長的最適pH為7。隨著pH的升高，菌落直徑逐漸下降。當pH為11時，菌落直徑最小，為3.23 cm(圖6)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)圖5 不同pH對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.5 Effects of different pH on mycelium growth of Alternaria alternate(Friss.) Keissler

圖6 不同pH對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.6 Effects of different pH on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

2.4 不同碳氮源對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響浙貝母黑斑病病菌可利用多種碳、氮源。但在供試碳源中，可溶性淀粉作為碳源的基礎培養基最適合病原菌菌絲的生長，其菌落直徑為3.82 cm，顯著高于其他碳源培養基上的菌落直徑，其次為甘露醇、葡萄糖、果糖；再次為蔗糖、木糖；該菌株在以纖維素為碳源的基礎培養基上生長最差(圖7～8)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)圖7 不同碳源對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.7 Effects of carbon source on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

圖8 不同碳源對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.8 Effects of carbon source on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

在不同氮源處理中，病原菌菌絲在胰蛋白胨培養基上生長最快，菌落直徑為4.38 cm，顯著高于其他氮源培養基上的菌落直徑，其次為牛肉浸膏、硝酸鈉、脯氨酸、硫酸銨、甘氨酸、氯化銨，而在以尿素為氮源的基礎培養基中生長最慢(圖9～10)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)圖9 不同氮源對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.9 Effects of nitrogen source on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

圖10 不同氮源對浙貝母黑斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.10 Effects of nitrogen source on mycelium growth of Alternaria alternate(Friss.) Keissler

3 討論

病原菌生物學特性是病害早期診斷、預測與防治的基礎[9-10]。浙貝母黑斑病病原菌交鏈孢菌(Alternariaalternate(Friss.) Keissler)的生物學特性目前國內外未見報道。該試驗結果表明，浙貝母黑斑病病原菌菌絲在7～33℃條件下均能生長，該菌的最適生長溫度為25 ℃，這與金華當地黑斑病發病規律相吻合。3月溫度較低、雨水較多、濕度較大，越冬病原菌開始活躍，隨著溫度升高病害迅速擴展蔓延至高峰。即溫濕度是影響該病害發生和流行的主要因素。病原菌在pH 4～11時均能生長，以pH 7最適，說明該病原菌喜好中性環境。在光照：黑暗=24：0條件下菌絲生長最快；最適菌落生長碳源為可溶性淀粉，最適氮源為胰蛋白胨。

該試驗對浙江省金華市磐安縣浙貝母黑斑病病原菌進行分離鑒定，對貝母黑斑病病原菌的生物學特性進行研究，試驗結果有利于植物病害的預報預警，為有效預防浙貝母黑斑病提供有力的技術支撐。