骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡的研究進展

左顯鋒，范建楠,，莫愁，羅嘉熠

1貴州醫科大學臨床醫學院，貴陽550004；2貴州醫科大學附屬醫院骨科

上世紀九十年代，國際骨性關節炎專題會議對骨性關節炎作出重新定義，骨性關節炎是指在力學和生物學因素的共同作用下，導致軟骨細胞、細胞外基質及軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯失衡的結果[1]。骨性關節炎的病理特征為關節軟骨局灶性缺如、骨贅形成、軟骨下骨改變及關節滑膜增生，其中，軟骨的異常改變是當今研究的主要方向，不過目前對于該病的發病機制以及主要病因暫時沒有明確的報道[2]。軟骨細胞的主要功能是將機體軟骨的完整程度進行良好維持，并使關節軟骨能夠獲得充分的負重能力[3]。關節軟骨細胞凋亡在骨性關節炎患者的病程進展中扮演重要角色，其與多條信號轉導通路有著緊密的聯系。現從骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡的基本概念、特征、誘發因素、凋亡途徑及其調節等方面進行綜述。

1 骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡的基本概述

有學者在1972年首次對細胞凋亡進行描述，發現細胞凋亡和細胞壞死的死亡方式有一定的區別，前者被稱為程序性細胞死亡[4]。研究認為，在細胞中事先就存在導致細胞凋亡的程序，在程序沒有被觸發時細胞表現正常，若程序在各種因素影響下被觸發，則細胞凋亡隨即開始。相關研究報道顯示，在骨性關節炎關節軟骨中存在著軟骨細胞的過度凋亡情況[5]。采用熒光激活細胞分類法對人類正常關節軟骨及骨性關節炎關節軟骨進行觀察發現：人類正常關節軟骨細胞凋亡占比約為5%，而骨性關節炎關節軟骨細胞存在20%左右的凋亡現象。在對家兔模型進行研究對比時也發現了同樣現象，骨性關節炎模型對象的軟骨細胞凋亡數量及占比顯著增加，約為正常關節軟骨的5倍[6]。雖然現存理論說明了關節軟骨細胞凋亡與骨性關節炎之間有關聯性，但難以確定關節軟骨細胞凋亡的根本原理及機制。多數觀點認為以下幾個環節可能對關節軟骨細胞凋亡產生影響，即：體內信號傳遞系統、誘導因子、細胞內調節誘導因子以及蛋白水解鏈式反應等[7]。Fas配體、腫瘤壞死因子等軟骨細胞凋亡誘導因子與細胞表面的相應受體相結合，結合后對早期信號傳遞分子進行聚集，鏈式反應酶系統從而被激活，在依次激活的過程中，不斷放大死亡信號，促進細胞凋亡進程[8]。

2 骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡的特征

對骨性關節炎患者的關節軟骨進行連續切片觀察發現，軟骨細胞的凋亡表現為病灶性，而非散在分布[9]。患者軟骨表面會受到細胞核固縮以及細胞破損的影響而出現數量較多的腔隙，且形態與基質小泡樣及溶酶體空腔隙類似。骨性關節炎患者的關節軟骨中層以及表層為出現關節軟骨細胞凋亡的主要位置。雖然正常關節軟骨細胞也會出現凋亡，但大多位于表層，而且不會輕易被檢出[10]。

3 骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡的誘發因素

3.1 生物化學因素 常見的生物化學因素主要包括藥物、毒素及重金屬等，這些因素均能使機體關節軟骨受到程度不一的影響[11]。例如，硝普鈉作為一氧化氮供體中的一種，會通過生產外源性一氧化氮，進而引起軟骨細胞產生凋亡現象，最終誘導產生疾病。再如，T-2毒素的毒性較強，極小的劑量即可對體外培養的大鼠關節軟骨細胞造成損傷，主要表現為促進軟骨細胞的凋亡及變性，抑制軟骨細胞的增殖[12]。

3.2 物理因素 該因素在所有誘發因素中占據了較高的比重，占據著主導地位。常見的物理因素有紫外線輻射、熱休克和機械力學作用等[13]，上述因素均會致使患者軟骨細胞產生凋亡。對于機械外力影響因素來講，機體還會受到組織被動作用時間長短及外力大小變化等因素的影響，調節軟骨細胞發生凋亡的程度[14]。

3.3 年齡 長期以來，骨性關節炎被認為是一種退行性疾病。觀察表明，骨性關節炎的發病機制是多方面的，老齡化是其發展的關鍵因素。隨年齡增大，關節也會呈現出程度不同的勞損問題，繼而導致關節軟骨退變、細胞凋亡逐步加重，引發原發性骨性關節炎[15]。

3.4 氧化應激 作為一種生物活性因子，活性氧簇可在機體病理狀態或一些生理狀態下產生[16]。過氧化氫產生后，一方面對細胞脂質進行過氧化，另一方面可以調節其凋亡相關的基因，從而對機體軟骨細胞的增殖形成抑制，同時促進軟骨細胞凋亡，最終破壞軟骨組織[17]。

4 骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡的途徑

骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡主要包括兩種途徑[18]，一種為一氧化氮途徑，另一種為Fas途徑。

4.1 一氧化氮途徑 一氧化氮屬于細胞毒性物質的一種，最早發現于上世紀八十年代。一氧化氮具有高度彌散性以及反應性，廣泛存在于生物體中，可以形成無機小分子，繼而產生較強的殺傷效果[19]。一氧化氮主要通過以下兩種途徑對骨性關節炎患者產生關節軟骨損傷作用。其一，一氧化氮在高濃度狀態下，可以對檸檬酸循環、線粒體電荷傳遞系統產生的酶進行抑制；其二，超氧化陰離子與一氧化氮作用后可產生過氧化亞硝基陰離子，最終形成具有較強毒性的自由基[20-21]。此外，還有一些臨床研究發現，外源性或內源性一氧化氮都會以線粒體途徑作為介導，對患者機體的關節軟骨細胞凋亡進行誘導。軟骨細胞在通過一氧化氮、內源性供體磷酸酯、活性氧及細胞色素C等因子干預后，其Caspases-3活性升高、DNA裂解加快，促進了細胞凋亡的進程[22]。研究顯示，在臨床中治療骨性關節炎時，將L-單甲基精氨酸作為一氧化氮合酶抑制劑使用，可以使患者的一氧化氮等細胞凋亡標志物表達降低[23]。可見，在骨性關節炎軟骨細胞的凋亡途徑中，一氧化氮途徑可能是誘導其凋亡的重要途徑之一。

4.2 Fas途徑 Fas屬于I型跨膜糖蛋白，位于細胞膜上，也被叫做Apo-1或者CD95，是腫瘤壞死因子或神經生長因子受體中的一種。在人類軟骨細胞中，Fas基因主要分布排列在第10號染色體。Fas途徑是一條公認的細胞程序性死亡信號傳導途徑，且在很多細胞中都存在Fas表達[24]。Fas配體(FasL)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子家族成員,在外周淋巴組織中表達,并可在T細胞激活過程中被誘導表達。FasL與Fas結合，會誘導出酪氨酸與絲氨酸/蘇氨的酸磷酸化反應，使細胞中鈣離子水平升高、細胞Caspases-3活性升高、DNA裂解加快，促使軟骨細胞凋亡[25]。體外研究還發現，Fas及FasL的表達還受細胞密度的調節，低密度區細胞不僅Fas表達較高密度區細胞高，且Fas的激活也是高密度區細胞的1.5倍[26]。

5 骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡的相關癌基因表達

5.1 c-myc 該基因在人體主要分布在第8號染色體，共包括3個外顯子，其蛋白質由439個氨基酸組成，主要在細胞核內存在。軟骨細胞處于正常狀態時，其細胞核中并沒有c-myc的表達，但處于凋亡狀態時，其細胞核中便會出現c-myc的陽性表達[27]。有學者采用免疫組化、電鏡以及ELISA等將骨性關節炎與正常人的關節軟骨細胞進行比較發現，軟骨退變與其細胞凋亡程度呈正相關，并且c-myc參與軟骨細胞的整個凋亡過程[28]。軟骨細胞因c-myc產生凋亡的主要原因是正常細胞周期失去了本該擁有的平衡狀態。

5.2 Bcl-2 該基因屬于一種原癌基因，被發現于濾泡性淋巴瘤細胞的染色體易位處，能抑制細胞凋亡，對細胞壽命有一定的延長作用。Bcl-2在機體中過表達會對Fas介導的細胞凋亡產生一定的抑制作用[29]。有學者對健康成年人及骨性關節炎患者關節軟骨細胞中Bcl-2的表達進行研究發現，骨性關節炎患者軟骨細胞中Bcl-2 mRNA的表達低于健康成年人[30]。這間接反映了機體對于細胞凋亡的自我調控，即可合理上調Bcl-2表達狀態，來促成對軟骨細胞的保護，進一步避免其出現凋亡的情況。另有研究發現，缺乏Ⅱ型膠原的轉基因鼠軟骨細胞呈現出明顯的過凋亡狀態，同時其Bcl-2表達降低[31-32]。以上研究表明，細胞中Bcl-2表達與骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡呈負相關。其他凋亡抑制因子是否參與其中，在Bcl-2家族中是否存在對關節軟骨細胞凋亡產生影響的其他成員，這些問題暫無明確定論，還需進一步探究。

5.3 p53 該基因主要分布于細胞核內，分為突變型及野生型。p53基因在健康關節軟骨細胞中表達陰性，但在病態關節軟骨細胞中表達陽性[33]。在機體細胞中，p53是重要的調節因子，能夠提供誘導細胞凋亡及限制細胞生長的信號，且屬于關鍵信號。有動物研究發現，膝骨性關節炎兔較正常兔p53 mRNA水平以及細胞凋亡數量高，表明p53在促使關節軟骨細胞凋亡中意義重大[34]。p53導致細胞凋亡的作用機制主要包括兩個方面：一方面，p53可以對細胞周期進行調節，致使細胞凋亡；另一方面，p53可以通過間接或直接的方式對細胞DNA的復制過程加以抑制。

6 核因子κB(NF-κB)信號通路在骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡中的調節作用

NF-κB是1986年發現的一種轉錄因子，屬于一種蛋白質復合物，特異性結合免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子區域。它最初被認為是B細胞分化和行使功能的調節因子，但后來被發現是各種細胞中普遍存在的轉錄因子[35]。NF-κB家族包括p65(RelA)、c-Rel、RelB、NF-κB1(p105/p50)和NF-κB2(p100/p52)，它們能兩兩結合形成同二聚體和各種異二聚體。其中，p65/p50異源二聚體最常見。NF-κB信號途徑的激活分為兩類，即“經典”和“替代”途徑。經典的NF-κB途徑由IKKβ調節，IKKβ由炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β或LPS激活；而選擇性NF-κB途徑則由一組TNFR超家族成員激活，包括CD40、淋巴毒素-β受體(LTβR)和NF-κB受體激活劑(RANK)[36]。

miRNA被認為是新的炎癥調節因子，其中miR-93因其在凋亡和炎癥抑制方面的作用而備受關注。miR-93高表達可以增強細胞活力、抑制細胞凋亡并減弱炎癥反應[37]，miR-93靶向NF-κB p50亞單位促進軟骨細胞存活及生長。TLR4是NF-κB信號通路的重要調節因子[38]，被確定為軟骨細胞中miR-93的直接靶點，并受miR-93負調控。該受體是病原體識別受體之一，因其具有識別骨性關節炎中微生物或宿主衍生配體的能力而在骨性關節炎中受到關注。NF-κB在炎癥損傷的誘導中起關鍵作用。在脂多糖(LPS)的刺激下，NF-κB從IκB分離并轉運至細胞核并調節炎性細胞因子的表達，從而導致關節軟骨細胞的凋亡和破壞，最終導致骨性關節炎的發生和進展。研究發現，miR-93過表達在體外和體內顯著抑制LPS誘導的NF-κB活化[39]。綜合表明，miR-93通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制LPS誘導的炎癥反應和軟骨細胞凋亡。

NF-κB在軟骨細胞存活和凋亡中具有雙相作用。NF-κB可防止TNF-α誘導的細胞凋亡，這種作用與誘導抗凋亡基因有關[40]。在軟骨細胞中，TNF-α誘導的凋亡也因NF-κB抑制而減少，NF-κB亞單位p65的Nkx3.2依賴性激活可增強ATDC5細胞的軟骨細胞存活并減少凋亡。同時，NF-κB也具有促凋亡功能。一些激活NF-κB的因子，如TCF4、SAM68和RIPK1，被發現可增強軟骨細胞的凋亡。此外[41]，NF-κB靶基因HIF-2α可加速Fas介導的骨性關節炎軟骨細胞凋亡。

NF-κB可以直接或者間接誘導基質金屬蛋白酶和其他骨性關節炎相關因子的表達，從而協調異常的軟骨細胞分解代謝途徑[42]。了解NF-κB激活在軟骨分解代謝途徑中的分子機制，可能會發現骨性關節炎的一些潛在治療靶點。

7 總結

目前，骨性關節炎有著年輕化發展的趨勢。生化、物理及年齡等均是骨性關節炎關節軟骨細胞凋亡的誘發因素；導致軟骨細胞出現凋亡的途徑主要包括一氧化氮和Fas途徑，也與c-myc、Bcl-2及p53等相關癌基因的表達有關；NF-κB信號通路與新識別的基因或通路之間的相互作用也與軟骨細胞凋亡存在著內在聯系。這些為臨床治療骨性關節炎提供了一定的理論支持。