RhoA/ROCK信號通路對免疫細胞的調控及其在心肌損傷中的潛在作用研究進展

張好東，王文娟，裴瑛，寇城坤，王瓊英，余靜

蘭州大學第二醫院高血壓中心，蘭州730000

心血管疾病已成為全球發病率最高的疾病之一，是威脅人類健康的一大殺手。心臟內的免疫細胞在心肌損傷后迅速激活，引發針對心臟的持續性自身免疫反應[1]。Ras同源家族成員A(RhoA)屬于RhoGTP亞家族蛋白，其能夠激活下游的ROCK激酶，進而影響細胞分子的生成與分泌，并產生相應的生物學效應，這一系列反應構成RhoA/ROCK信號通路。研究發現，RhoA依賴性信號傳導對于免疫細胞的激活至關重要，并且在心肌細胞的信號轉導和受體激活中發揮重要作用[2]。因此，對RhoA/ROCK信號通路與免疫細胞之間的作用機制進行深入了解，對于心臟疾病的治療尤為重要。本文就RhoA/ROCK信號通路通過調節免疫應答在心肌損傷中的潛在意義綜述如下。

1 RhoA/ROCK信號通路的生物學結構及作用

1.1 生物學結構 RhoGTP酶是小分子鳥苷酸三磷酸酶Ras超家族的成員之一，目前已被發現的20多種RhoGTP酶中，RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2、Rac3、Cdc42等較為經典。RhoA是Rho蛋白家族中目前為止研究最為透徹的成員,其本質為單體G蛋白，結構序列相對保守,可活化多種上游刺激信號,包括血小板源性生長因子(PDGF)、血管緊張素Ⅱ以及內皮素等。ROCK又稱Rho激酶，是分子質量為160 kDa的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶,與Rho蛋白共同參與調節平滑肌細胞的黏附、遷移、增殖和分化[3]。ROCK家族分為ROCK1(具有1 354個氨基酸，位于18號染色體上)和ROCK2(具有1 388個氨基酸，位于2號染色體上)兩個亞型，其氨基酸序列是由氨基端激酶催化結構域(RBD)結合Rho結構域的螺旋區域以及富含半胱氨酸的羧基端PH結構域形成的環狀結構共同組成。研究顯示，這二種亞型的氨基酸序列約有65%的同源性，ROCK1和ROCK2在全身組織中廣泛表達，ROCK1的表達在肝、肺、腎、脾和睪丸中居多,而ROCK2則在腦、心臟和肌肉中居多[4]。

1.2 生物學作用 Rho蛋白家族主要受GTP酶激活蛋白(GAP)和鳥苷酸交換因子(GEF)共同參與調節，表現為當信號激活時，GEFs分子催化核苷酸，使RhoGTP酶由結合GDP狀態轉換為結合GTP狀態，導致RhoGTP酶激活。相反，GAPs刺激GTP水解，導致RhoGTP酶失活。因此，RhoA可通過在活性GTP結合狀態/非活性GDP結合狀態之間相互轉換，充當“分子開關”的作用，從而在心肌細胞表面靶蛋白或細胞骨架中發揮生物學效應[5]。

RhoA/ROCK信號通路中，RhoA與GTP結合激活下游ROCK,并進一步磷酸化ROCK下游底物。目前發現ROCK最主要的作用底物有肌球蛋白輕鏈(MLC)、肌球蛋白磷酸酶(MLCP)的肌球蛋白結合亞單位(MYPT1)，ROCK與MLC結合可直接使MLC磷酸化并抑制MLCP活性，大量MLC磷酸化激動肌球蛋白，從而調控細胞骨架[6]。

此外，RhoA/ROCK信號通路在心血管系統中還具有如下生理特點：①減少血管內皮細胞分泌一氧化氮，使血管平滑肌對Ca2+的敏感性增加，誘發血管平滑肌細胞收縮[7]；②促進巨噬細胞分化，加速動脈粥樣硬化的進展[8]；③既可啟動炎癥反應又可促進炎癥反應，導致炎癥因子大量聚集，加重心肌缺血損傷[9]。

2 RhoA/ROCK信號通路在免疫細胞中的作用

免疫系統根據其免疫識別的機制和受體不同可分為先天免疫系統和適應性免疫系統。先天免疫系統通過模式識別受體激活，包括炎癥細胞因子的釋放和先天免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞及粒細胞進入機體組織而發揮生物學作用。適應性免疫系統與先天性免疫系統相反，它通過獲得病原體特異性受體來建立“免疫記憶”，還具有體液和細胞成分，可以與先天免疫系統相互作用[10]。RhoA是一種普遍表達的小GTP酶，不僅在重塑細胞骨架中充當分子開關，還可響應從先天性和適應性免疫細胞釋放的趨化因子、細胞因子和生長因子而被激活，在免疫反應中發揮重要作用。

2.1 先天性免疫細胞 先天性免疫細胞主要分為巨噬細胞、樹突細胞及粒細胞。巨噬細胞通過清除凋亡細胞以維持組織穩態，存在于不同組織中的巨噬細胞根據其所處環境的變化形成不同的巨噬細胞亞型，如M1巨噬細胞和M2巨噬細胞。M1巨噬細胞主要參與促炎反應，產生促炎相關因子如白細胞介素(IL)6、IL-12和腫瘤壞死因子(TNF)；而M2巨噬細胞主要參與抗炎反應。在機體感染時，巨噬細胞首先極化為促炎M1表型，以協助宿主對抗病原體；隨后，巨噬細胞極化形成對M2表型的抗炎反應并修復組織損傷[11]。

研究顯示，巨噬細胞遷移需要RhoGTP酶的活性，RhoGTP酶是肌動蛋白細胞骨架組織和細胞運動的重要調節因子，其中Cdc42、Rac1、RhoA和RhoB的研究最為深入。游走巨噬細胞具有極性，可出現頭部和尾部，頭部又可出現絲狀偽足和板狀偽足，從而引導巨噬細胞的定向游走。RhoA的缺失可抑制巨噬細胞尾部回縮，但增加了其遷移速度。此外，當表面整合素表達減少時，RhoB的缺失會損害原代小鼠骨髓巨噬細胞(BMM)的黏附并抑制其遷移。RhoA和RhoB共同缺失時會顯著改變靜息BMM的形態使其變為星狀形態，在趨化遷移過程中，共同缺失的細胞以比單個缺失細胞更快的速度移動[12]。與RhoA、RhoB同為RhoGTP酶的Rac和Cdc42也是巨噬細胞遷移的重要參與者，局部Cdc42信號傳導與趨化遷移過程中的導向細胞有關，而Rac對偽足形成來說必不可少[13-14]。

未成熟樹突細胞的遷移取決于兩個主要的肌動蛋白池，即位于細胞后部的后部的RhoA-mDia1依賴性肌動蛋白池(有助于樹突細胞向前遷移)及位于前端的Cdc42-Arp2/3依賴的肌動蛋白池(促進抗原捕獲但限制了遷移)。在樹突細胞成熟過程中，細胞前沿的Cdc42-Arp2/3依賴性肌動蛋白顯著減少，成熟后的樹突細胞主要通過RhoA-mDia1依賴性運動模式進行趨化遷移[15]。鼠樹突細胞中MYO9B基因的缺乏可導致RhoA信號傳導活性升高以及Rho靶蛋白cofilin失活，提示MYO9B可能成為樹突細胞中Rho/RhoA效應器Rho激酶/LIM域激酶信號通路的負關鍵調節因子，以誘導適應性免疫應答[16]。

粒細胞遷移也需要Rac和RhoA的參與。Rac1可調節尾足類動物中的中性粒細胞Rho活性，從而調節肌球蛋白Ⅱ介導的粒細胞收縮性。研究發現，Rac1和Rac2雙缺陷小鼠獲得的粒細胞特征可表現為RhoA的活性減弱[17]。此外，Cdc42和RhoA均可調節磷酸酶和張力蛋白同源物的時空活性，從而調節細胞遷移的方向[18]。由上可見，RhoA/ROCK信號通路對于先天性免疫細胞的激活和遷移至關重要。一般來說，后端的RhoA上調和免疫細胞前緣的RhoA抑制有助于細胞定向遷移。因此，在空間和時間層面上嚴格控制RhoA/ROCK信號通路可調控免疫系統，以發揮有效的免疫應答。

2.2 適應性免疫細胞 適應性免疫細胞一般包括T淋巴細胞及B淋巴細胞，這些免疫細胞中RhoA的表達同樣受空間和時間方式的高度控制。RhoA的激活與T淋巴細胞受體(TCR)相關,TCR可以識別其他細胞表面的主要組織相容性復合體及抗原復合物，進而誘導下游的多種信號通路，增強其他免疫細胞的協同刺激和促炎作用[19]。T淋巴細胞通過組織細胞外基質進行遷移，需要激活膠原蛋白受體盤狀結構域受體1(DDR1)誘導的RhoA/ROCK/ERK信號通路從而發揮生物學效應[20]。研究發現，RhoA缺乏會抑制輔助性T淋巴細胞(Th)2和Th17細胞分化，但對Th1、誘導調節性T淋巴細胞(iTreg)和天然調節性T淋巴細胞(nTreg)分化沒有影響。而Cdc42可抑制Th1和Th17細胞的分化，但促進Th2和iTreg細胞的分化以及nTreg細胞的穩定性[21]。

RhoA也是B淋巴細胞活化的重要調節劑，其能夠以高親和力結合蛋白抗原來觸發B淋巴細胞受體(BCR)從而激活BCR相關的脾酪氨酸激酶，后者能夠通過B淋巴細胞接頭蛋白反過來激活在轉化生長因子β受體及表皮生長因子受體的下游發揮重要作用的Vav2，具體表現為一方面刺激Rac和Cdc42，另一方面激活RhoA[22]。此外，活性RhoA可通過對肌動蛋白切斷蛋白cofilin的影響來限制BCR的遷移，從而干擾TOLL樣受體配體，增強BCR信號傳導的能力[23]。由上可見，RhoA/ROCK信號通路的激活可以影響適應性免疫細胞的遷移和刺激能力。

3 RhoA/ROCK信號通路調節免疫應答在心肌損傷中的作用

心肌細胞損傷時，會釋放帶有危險相關分子模式的危險信號，這些信號被模式識別受體識別，并由特定的免疫細胞和心肌細胞表達。在受損的心肌組織中，M1巨噬細胞具有清除壞死組織的能力，當吞噬凋亡細胞時，巨噬細胞釋放抗炎細胞因子，促進巨噬細胞群向修復表型轉變，這有助于抑制炎癥損傷并改善心臟重塑。M2巨噬細胞則可抑制CD4+T淋巴細胞和粒細胞活性，從而改善心功能。有學者使用心肌球源性細胞進行研究，發現浸潤的巨噬細胞可以在缺血心臟中獲得心肌保護表型，并通過激活心肌細胞中的抗凋亡程序來減輕心肌損傷的程度[24]。T淋巴細胞在改善心肌損傷中也發揮著重要作用，研究顯示，調節性T淋巴細胞可以減少受損心臟中促炎細胞的浸潤并防止心力衰竭的發生。多項研究表明，RhoA依賴性信號傳導對于有效的免疫細胞激活以及心肌細胞中危險信號的轉導發揮著重要作用。RhoA信號通路可參與巨噬細胞的極化，介導樹突細胞和T淋巴細胞之間的相互作用，促進促炎和抗炎表型的重塑，進而參與心臟功能障礙的的發生發展。LIU等[25]研究發現，RhoA的缺失會下調巨噬細胞中CX3CR1/CX3CL1信號傳導，抑制巨噬細胞浸潤，阻止血管閉塞，消除小鼠心臟同種異體移植物的慢性排斥。因此，RhoA/ROCK信號通路的激活可以調節免疫反應以發揮保護心肌損傷的作用。

綜上所述，心肌損傷的發生發展及轉歸需要心肌細胞及先天性、適應性免疫細胞的共同參與，其中涉及細胞內多種信號的傳導，RhoA是關鍵介質之一。RhoA/ROCK信號通路在免疫系統中的激活及RhoA依賴性下游信號的傳導在心肌細胞和免疫細胞中均起著重要作用，然而其具體機制尚不明確。此外，Rho/ROCK信號通路在不同組織細胞中的不同作用、Rho/ROCK信號通路抑制劑及其針對靶點不同而導致的不同生理功能影響等都需要進一步闡明。隨著對RhoA/ROCK信號通路的深入研究，相信其未來一定能為心肌損傷的臨床診療提供新的高效途徑。