睪丸位置不同的隱睪患兒睪丸引帶組織雄激素受體表達觀察

高靖達，齊燦，周云，張鐵軍，史麗萍，許鵬，賈鵬宇

河北省兒童醫院泌尿外科，石家莊 050000

隱睪又稱睪丸下降不全，是指患兒出生時單側或雙側睪丸未能正常降入陰囊內，是小兒泌尿外科常見的先天性畸形之一。新生兒隱睪發病率2%～5%，是導致不育及睪丸癌的危險因素。目前隱睪的發病機制尚未完全闡明，睪丸引帶的牽拉作用可能在睪丸下降過程中發揮重要作用。睪丸的分化和發育與雄激素密切相關，雄激素必須通過其靶器官雄激素受體（AR）的介導才能發揮其生物學作用。研究［1］發現，睪丸引帶組織中存在AR 表達，睪丸引帶可能作為睪丸下降過程中雄激素作用的靶器官，在雄激素的作用下睪丸引帶發生結構變化，參與睪丸下降過程。我們觀察了不同睪丸位置的隱睪患兒睪丸引帶組織AR表達情況，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2020 年1 月—2021 年8 月間河北省兒童醫院泌尿外科收治的單側隱睪患兒55例，其中左側隱睪26 例，右側隱睪29 例，；根據睪丸位置分為腹腔型隱睪18例、腹股溝型隱睪25例和陰囊高位型隱睪12 例；腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型睪丸引帶長度分別為（2.3 ± 0.4）、（3.1 ± 0.3）、（3.6 ± 0.5）cm。排除標準：①雙側隱睪患兒；②伴發其他泌尿生殖系統畸形患兒；③接受內分泌治療及其他促進睪丸下降的治療患兒。根據睪丸位置將患兒分為腹腔型隱睪、腹股溝型隱睪和陰囊高位型隱睪。本研究已通過河北省兒童醫院倫理委員會的批準，獲得患兒家長同意。

1.2 隱睪患兒睪丸引帶組織AR 檢測 患兒麻醉后觸診確定睪丸位置，經腹股溝切口找到睪丸，睪丸引帶為睪丸遠端向陰囊走形的唯一條索狀組織，提起睪丸牽拉引帶，可見與引帶遠端相連的皮膚回縮，回縮處為睪丸引帶附著點，引帶長度為睪丸遠端到睪丸引帶附著點之間的距離。術中留取患兒睪丸引帶近端組織標本。分別采用免疫組織化學法、WESTERN Blotting 法檢測患兒睪丸引帶組織AR。①免疫組織化學法：取標本，石蠟包埋4 μm 切片，70 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS 洗滌3 次，微波爐抗原修復（中高火5 min，中低火20 min），冷卻至室溫，PBS洗滌3次，3%H2O2避光室溫孵育10 min，PBS 洗滌3 次，滴加特異性一抗體，4 ℃孵育過夜，第二天恢復室溫后PBS 洗滌3 次，滴加二抗，37 ℃孵育40 min，PBS 洗滌3 次，DBA 顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察，在顯微鏡下×400倍隨機選擇10個區域，使用Image Pro Plus 軟件測定平均光密度值，并以10 個視野下測的光密度值的平均值作為標本AR光密度值。研究重復3 次，取平均值。②WESTERN Blotting 法：采用組織裂解法提取睪丸引帶組織總蛋白，Bradford 法測量蛋白質含量，SDS-PAGE 電泳分離蛋白質，硝酸纖維素膜轉膜，脫脂奶粉封閉，AR（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，化學發光法顯色。以β-actin 為內參，用IMAGE J 軟件分析目的條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值比值作為AR 相對表達量。研究重復3次，取平均值。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以±s表示，所有數據進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析；采用PEARSON 相關性分析及線性回歸法分析睪丸引帶長度與隱睪患兒睪丸引帶組織AR 光密度值的相關性。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

免疫組織化學檢測結果為：腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR 的光密度值分別為（212.67 ± 82.84）×10-4、（288.76 ± 68.70）×10-4、（375.75 ± 52.08）×10-4，腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR 光密度值逐漸升高，兩兩比較，P均<0.05。

WESTERN Blotting結果為：腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR 相對表達量分別為0.60±0.10、0.78±0.10、0.89±0.10，腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR相對表達量逐漸升高，兩兩比較，P均<0.05。

腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型睪丸引帶長度分別為（2.3 ± 0.4）、（3.1 ± 0.3）、（3.6 ± 0.5）cm 睪丸引帶長度與隱睪患兒睪丸引帶組織AR 光密度值呈負相關（r=-0.770，P<0.001）。

3 討論

小兒隱睪癥是小兒泌尿外科常見疾病，目前對于隱睪的發病機制目前尚未闡明。睪丸下降過程是一多因素、多階段參與的復雜的生理過程，其主要包括腹腔內下降階段和腹股溝陰囊下降階段兩個階段［1-2］。睪丸下降第一階段主要發生于胚胎10～23周左右，目前研究表明，腹腔內階段睪丸的下降主要是由睪丸Leydig 細胞分泌的胰島素樣因子-3（Insu‐lin like3、INSL-3）在這以階段發揮重要作用［3］，其主要通過睪丸引帶上的INSL-3 受體，刺激睪丸引帶生長牽拉睪丸，將睪丸從腎周分離出來，牽拉至腹股溝去。INSL-3受體目前已經被確定為富含亮氨酸G蛋白耦聯受體8（leucine-richG-protein-coupled recep‐tor8，LGR8），其在睪丸曲細精管細胞膜表面結合，激活G 蛋白，使位于內膜表面的腺苷酸環化酶活性上調，從而促進引帶細胞分化，睪丸位置下降。INSL-3基因突變可能影響LGR8 結構、活性及表達量，進而導致引帶退化而使睪丸下降受阻，最終導致隱睪。睪丸下降第二階段主要始于胚胎26～28 周，至出生完成，目前認為，雄激素在此階段發揮重要作用［4］，并且誘導腹股溝管和外生殖器官的發育，在此過程中睪丸引帶扮演重要的角色，但雄激素通過何種途徑和機制影響引帶，并通過它進一步影響生殖系統的發育尚存在很大爭議。GEORGE 等［5］首次研究發現，睪丸引帶上存在AR 表達，為雄激素的直接作用提供了理論依據。PARK等［6］研究發現，在睪丸下降過程中睪丸引帶存在節律性收縮，該過程與生殖股神經（GFN）及其神經遞質降鈣素基因相關肽（CGRP）的調節相關，并進一步證實了雄激素可能通過位于脊髓的GFN 核上的AR 調節GNS末梢分泌CGRP，CGRP再作用于睪丸引帶CGRP受體，發揮影響睪丸引帶的作用。

在孕早期，胎兒睪丸引帶由稀疏的膠原纖維和松散的細胞外基質構成，隨后膠原纖維不斷增加，彈性纖維也以同樣的方式增加，纖維母細胞成為占主導地位的細胞類型，隨著孕齡的增加而降低，平滑肌細胞主要位于血管壁；橫紋肌細胞位于睪丸引帶的遠端近陰囊處，分成不同方向的幾束，其含量隨孕齡的增加而降低［7］。睪丸引帶在睪丸下降過程中的不同階段發生著不同的變化，主要可以分為引帶組織腫脹階段和引帶組織退化階段。第一階段主要表現為以下特征：細胞明顯增殖，粘多糖及透明質酸鈉大量積聚，細胞內水分增多，細胞外基質增多［8-9］。HO‐SIE 等［10］提出雄激素對睪丸發育影響有可能通過增加粘多糖引起睪丸引帶組織腫脹，擴張腹股溝管，從而促進睪丸下降。林慶軍等［11］通過對小鼠引帶組織AR 表達的研究發現睪丸引帶積極參與了睪丸一期下降過程，并且與雄激素代謝密切相關，雄激素通過引帶AR 增強引帶發育，并促進或成為睪丸下降奠定基礎。第二階段主要表現為伴隨睪丸下降，睪丸引帶長度的縮短；在雄激素介導作用下，細胞內積聚的粘多糖及透明質酸鈉成分降解，細胞外基質呈脫水改變，睪丸引帶細胞出現凝聚反應［12］。雄激素缺乏與睪丸引帶退化失敗關系密切，兩者的密切關系對于闡明雄激素介導睪丸下降具有重要意義［13］。

BARTECZKO 等［14］研究認為，睪丸引帶發育可分為三個時期：Ⅰ期為早期，引帶結構通過中腎管皺褶的尾部與腹側壁相連至臍動脈；Ⅱ期可看到引帶的腹側面緊密連接于腹膜鞘突的背側面，在它們的相交處引帶頭端插入生殖管的間質部，引帶尾端將睪丸尾端和生殖管間質的背部連在一起。Ⅲ期時可以觀察到引帶的內部結構并可通過性腺位置判斷性別，此期睪丸體積增大并靠近生殖管的間充質。并且研究還發現睪丸引帶與腹膜鞘突的結構和排列與睪丸下降關系密切，與臨床上隱睪總是與睪丸引帶和腹膜鞘突異常關聯的情況一致。

睪丸與附睪自腹腔內的下降過程中依賴于位于其遠端的睪丸引帶的發育和重塑。對于睪丸引帶的作用機制，現在認為睪丸引帶上存在許多與睪丸下降有關的受體，多種因子作用于睪丸引帶上的這些受體后會產生收縮性改變和位置遷移，從而促使睪丸下降。本研究中觀察了不同睪丸位置的患兒睪丸引帶組織AR 表達后發現，睪丸位置較高的隱睪患兒睪丸引帶組織AR 低表達，睪丸引帶長度較長，隨著睪丸位置的降低，睪丸引帶長度逐漸縮短，睪丸引帶組織中AR 表達增多，且睪丸引帶長度與睪丸引帶組織AR 表達成線性相關。在睪丸進入陰囊階段，睪丸引帶引導睪丸通過擴張的腹股溝管進入陰囊，同時引帶逐步縮短退化，含水量不斷減少，纖維成分不斷增加，最終退化成纖維帶，錨定睪丸于陰囊內［15］。劉新福等［16］研究表明睪丸引帶參與引導和牽拉睪丸進入腹股溝和陰囊，并最終退化形成在附睪與陰囊之間固定睪丸并阻止其上升。目前研究均已表明睪丸下降過程中第二階段，睪丸引帶組織退化的重要作用，與本研究中隨睪丸位置降低，睪丸引帶組織退化的表現相一致，進一步說明在睪丸下降第二階段過程中雄激素發揮重要作用。

綜上所述，陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR 表達高于腹腔型、腹股溝型患兒。睪丸引帶長度與隱睪患兒睪丸引帶組織AR 光密度值呈負相關。睪丸位置較高的隱睪患兒睪丸引帶組織AR 表達低，睪丸引帶長度較長。睪丸引帶組織AR 表達可能參與了睪丸下降。深入研究雄激素在睪丸引帶發育中的作用機制，有利于進一步對睪丸下降機制的了解，為激素治療隱睪理論研究提供新思路。