肝癌腫瘤微環境中CD8+細胞毒性T淋巴細胞的研究進展

張艾，李海洋

1 貴州醫科大學臨床醫學院，貴陽 550004；2 貴州醫科大學附屬醫院肝膽外科

肝細胞癌（HCC）簡稱肝癌，占原發性肝癌的90%，是全球第7 大常見癌癥，亦是癌癥相關死亡的第2 大常見原因［1-2］。我國是肝癌大國，肝癌位居我國癌癥死因的第二位，亦是慢性肝病患者最常見的死亡原因［3］。乙肝病毒的慢性感染是全球肝癌發生的主要原因，其次是酗酒、丙肝病毒慢性感染、與代謝綜合癥相關的脂肪肝疾病，以及其他不常見可能會導致肝硬化的疾病，包括原發性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎和血色病等，最后是肝癌存在的重要環境危險因素，如含黃曲霉毒素B1的膳食等。目前針對肝癌治療方法有手術切除、肝移植、射頻消融、局部放化療等，然而只有手術切除和肝移植是潛在的治愈方法，盡管多激酶抑制劑索拉非尼為代表的分子靶向治療藥物取得重大進展，但索拉非尼治療肝癌的5 年生存率極低，晚期肝癌的預后仍較差。與常規治療方法相比，腫瘤免疫療法主要利用腫瘤微環境（TME）內外的免疫細胞對癌細胞進行特異性識別和攻擊，理論上可使免疫療法具有更高的特異性和更小的不良反應。作為典型的抗腫瘤首選免疫細胞，CD8+細胞毒性T 淋巴細胞（CTL）以抗原特異性方式識別腫瘤細胞并分泌細胞毒物質介導腫瘤細胞凋亡。充分了解肝癌TME、CTL 特點和相互作用是免疫治療成功的關鍵。現就肝癌TME 中CTL 的研究進展綜述如下。

1 肝癌TME的作用

TME 是指圍繞并滋養腫瘤細胞的組織環境，其特征是成分復雜，包括各種類型的免疫細胞、其他非轉化細胞、分泌型分子、細胞外基質和血管等。TME在不同類型的癌癥之間及在相同類型癌癥的不同患者間存在較大差異。腫瘤細胞可動態改變其微環境，而微環境亦可影響腫瘤細胞的生長和擴散。適應性和先天性免疫系統的免疫細胞是TME 的主要成分，它們與腫瘤細胞建立動態相互作用，最終通過抑制免疫細胞的抗腫瘤活性促進腫瘤生長。這種現象亦發生于肝癌患者中。在生理情況下，肝臟具有豐富的免疫浸潤細胞與非實質細胞，如肝竇內皮細胞（LEC）和庫普弗細胞（KC）合作維持免疫抑制微環境，有利于對腸道抗原的自我耐受。病理情況下，肝癌的發生是復雜動態過程，包括三個階段：起始、進展和轉移。肝癌被細胞外基質和基質中的非癌細胞包圍，TME 的生理狀態與肝癌發生的每一階段密切相關。幾乎所有主要的肝癌相關腫瘤免疫細胞在肝癌TME 中有重要意義，包括髓源性抑制細胞（MDS）、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、腫瘤相關中性粒細胞（TAN）、調節性T 細胞（Treg）、CTL、自然殺傷（NK）細胞、庫普弗細胞（KC）、樹突狀（DC）細胞等［4］。

肝癌具有獨特的TME，在腫瘤起始階段可激發免疫反應防止腫瘤發生。諸多免疫抑制機制，包括免疫抑制細胞群在腫瘤內積累、抗原呈遞缺陷和多種抑制性受體—配體通路的激活，均有利于形成免疫耐受，并促進肝癌進展。TME 中免疫抑制的程度與肝癌患者的不良預后密切相關。免疫細胞是肝癌進展的關鍵參與者，它們的募集和功能受到TME 的影響，是決定腫瘤命運及其侵襲和轉移能力的基礎。腫瘤相關免疫細胞可分為兩種類型：抗腫瘤和促腫瘤免疫細胞。兩種類型的細胞在腫瘤進展的不同階段發揮不同作用。作為典型的抗腫瘤免疫細胞，CTL 通過其識別和消除腫瘤細胞的能力在抗腫瘤免疫中發揮重要作用，CTL 是針對腫瘤（包括肝癌）的特異性細胞免疫的最重要執行者，尤其是腫瘤細胞巢中的CTL 發揮主導作用。目前，多數針對免疫療法的研究廣泛關注增強CTL的細胞毒活性。

2 肝癌TME中CTL的功能

CTL 是用于靶向治療癌癥的首選免疫細胞，來源于T 細胞分化的效應CD8+αβT 細胞，細胞毒性是CTL 的主要功能。CTL 在破壞病毒感染細胞和癌細胞方面發揮主要作用。幼稚CD8+T 細胞通過CCR7再循環或CCR4/5 等趨化因子的作用被招募到引流淋巴結（dLN），未成熟的樹突狀細胞對腫瘤抗原進行采樣后，以CCR7和XCR1趨化因子受體依賴性方式遷移到引流淋巴結并將抗原通過CD8+T細胞表面的TCR 呈遞給幼稚CD8+T 細胞，樹突狀細胞和CD8+T 細胞間的相互作用以受體—配體相關方式介導，CD8+T 細胞表面受體共刺激分子CD27 和CD28分別與抗原呈遞細胞上的配體B7 分子產生共刺激信號激活T 細胞受體（TCR）導致CD8+T 細胞增殖和活化成為CTL，CTL 下調歸巢受體CCR7 并上調BLT1、CXCR3、CCR5 和CX3CR1 等趨化因子受體，遷移至TME，導致腫瘤細胞凋亡［5］。

CTL介導的腫瘤細胞凋亡機制主要有兩種。一種是在腫瘤細胞識別時誘導的脫胞粒作用。CTL通過TCR 識別由主要組織相容性復合體I 類分子（MHC-I）呈遞在腫瘤細胞表面的外源或修飾的特定抗原肽，觸發信號分子在CTL 和靶細胞之間的形成的免疫突觸，通過TCR 激活CTL 內鈣的增加和分泌性溶酶體向免疫突觸的極化，淋巴細胞功能相關抗原-1 和CD103 整合素等主要黏附和共刺激分子在CTL 上分別通過與其同源配體、細胞間黏附分子1（或CD54）和E-鈣黏蛋白相互作用，并在免疫突觸處將裂解顆粒的胞吐作用引導至腫瘤細胞表面，最終通過分泌型溶酶體向腫瘤細胞釋放細胞毒性物質，如可溶性的顆粒酶B、穿孔素等，穿孔素在靶細胞的膜上產生孔洞，顆粒酶B 通過孔洞進入啟動各種凋亡途徑［6］。TAMZALIT 等［7］發現，即使在無穿孔素的情況下，CTL亦可通過機械運動介導腫瘤細胞凋亡。另一種機制是通過細胞表面受體的結合激活腫瘤細胞的自我凋亡過程。此外，CTL 還可通過分泌細胞因子IFN-γ和TNF-α，獨立于MHC的機制，間接攻擊腫瘤細胞，在不影響體內其他細胞的情況下殺死腫瘤細胞。CTL 在介導腫瘤細胞凋亡后，會尋找臨近的腫瘤細胞繼續介導其凋亡，CTL 是典型的抗腫瘤免疫細胞，在抗腫瘤免疫中起關鍵作用。然而，在肝癌免疫抑制性TME 和延長腫瘤抗原暴露的背景下，腫瘤特異性CTL 容易分化為稱為“T 細胞耗竭”的階段。耗竭的CTL 不同于具有功能性的效應和記憶CTL，表現為細胞因子產生能力（IL-2、TNF-α 和IFNγ 等）和殺傷能力的不同程度喪失，細胞增殖受損，細胞毒活性降低，關鍵轉錄因子的表達和使用改變，代謝紊亂，尤其是多種抑制性受體的持續上調和共表達等［8］。耗竭的CTL 作為小鼠和人類的獨特細胞譜系出現，其特征就是抑制性受體的高表達，如PD-1、TIGIT、TIM-3 和LAG-3 等免疫檢查點分子［9］，耗竭的CTL表達的免疫抑制受體強度和數量與CTL衰竭的嚴重程度呈正相關。WANG 等［10］發現，在肝癌TME 中CTL 表達上調的胸腺細胞選擇相關的高遷移率族框蛋白（TOX）調節PD1 的內吞循環，促進CTL耗竭影響肝癌進展。

3 肝癌TME成分對CTL功能的影響

肝癌TME 中CTL 的存在與改善肝癌的存活率相關，而TME 成分對CTL 的影響是肝癌抗腫瘤免疫的關鍵因素，微環境成分通過多種機制對CTL 介導的抗腫瘤免疫反應產生影響。肝纖維化是肝癌的一個突出特征，會削弱CTL對血小板衍生的CD44的識別，減少CTL 的浸潤和黏附在肝竇上所進行的免疫監視［11］。就肝癌TME 中細胞成分而言，CTL 與抗腫瘤免疫細胞具有正串擾作用，而與促腫瘤免疫細胞具有負串擾作用。髓源性抑制細胞是起源于骨髓的異質性未成熟骨髓細胞群，在病理條件下擴增并上調免疫抑制因子的表達，是肝癌微環境中重要的促腫瘤細胞。ZHOU 等［12］發現，肝癌TME 中髓源性抑制細胞能夠有效抑制CTL 增殖和功能。此外，髓源性抑制細胞表達的凝集素Galectin-9 可和CTL 高表達的免疫抑制受體TIM-3 結合，誘導CTL 凋亡。腫瘤相關巨噬細胞包括組織駐留巨噬細胞和由炎癥刺激動員的骨髓來源的單核細胞衍生的巨噬細胞，具有抗腫瘤M1 和促腫瘤M2 兩種極化表型。調節性T細胞可由外周血T 淋巴細胞、常駐T 細胞和其他細胞分化而來，是肝癌主要的促腫瘤免疫細胞。調節性T 細胞抑制腫瘤相關抗原呈遞，且能通過抑制顆粒酶和穿孔素的產生和釋放來削弱CTL 的殺傷能力，同時選擇性地抑制CTL分泌的細胞分子（如IFNγ、TNF-α 等）。YANG 等［13］發現，調節性T 細胞表達可溶性纖維蛋白原樣蛋白2通過減弱樹突狀細胞介導的CTL活性促進肝癌生長。

作為先天性免疫系統的主要免疫調節細胞，NK細胞具有細胞毒功能，可以直接殺死腫瘤細胞而無需抗原致敏，在抗腫瘤免疫中和CTL具有協同作用。庫普弗細胞（KCs）是維持肝臟免疫穩態的重要組成部分，是人類肝癌微環境中主要表達B7-H1的細胞，并通過B7-H1 與耗竭的CTL 上的PD-1 相互作用介導細胞毒功能下降。CD4+T 淋巴細胞是CTL 反應的輔助細胞。CD4+T 淋巴細胞參與調節抗腫瘤免疫與CTL的啟動有關，通過分泌細胞因子（如IFN-γ）激活抗原呈遞細胞和主要組織相容性復合物I 類分子（MHC-I）增強抗原呈遞作用，優化CTL 的細胞毒性分子表達、抑制性受體的下調和遷移能力的增加［14］。除了肝癌TME 中的經典免疫細胞外，其他成分亦嚴重操縱CTL功能。肝癌細胞亦能通過表達的精氨酸酶剝奪CTL的精氨酸和CTL形成嚴重的代謝競爭，進而抑制腫瘤特異性CTL 反應。SHAO 等［15］研究發現，人類肝癌細胞中過表達的轉錄調節因子CHD4/NuRD 復合物和抗腫瘤免疫反應中的關鍵免疫CTL和樹突狀細胞浸潤呈負相關。以及物理條件如乳酸、低pH、缺氧等都會限制腫瘤相關抗原特異性CTL 反應［16］。HAN 等［17］研究提示，肝癌免疫調節細胞CD14+CTLA-4+調節性樹突狀細胞，可通過IL-10 和IDO 的產生抑制CTL 反應。JIN 等［18］在小鼠肝癌模型中發現，來自上皮細胞和免疫細胞釋放的IL-33 可促進活化和效應CTL 的百分比和數量增加，上調CTL 的IFN-γ 產生，增強CTL 的細胞毒性，進而產生抗腫瘤效應。此外，抑制腫瘤CCRK 或肝臟IL-6會增加CTL 浸潤和致瘤性受損，并通過髓源性抑制細胞的恢復而恢復，腫瘤CCRK 耗竭上調PD-L1 表達，增加瘤內CD8+T 細胞表達，從而增強PD-L1 阻斷肝癌的作用［19］。

4 基于CTL的肝癌免疫治療進展

在癌癥免疫治療中，體內腫瘤細胞主要被CTL或NK 細胞殺死，CTL 還具有殺死對NK 細胞具有抗性的腫瘤細胞的能力，而調節性T 細胞和髓源性抑制細胞可抑制抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤生長和轉移。因此，肝癌免疫治療旨在通過直接或間接的干預增強CTL 的持久反應或抑制調節性T 細胞和髓源性抑制細胞的作用。而CTL的募集和重新激活被認為是癌癥的關鍵治療策略。目前已嘗試開發的諸多免疫治療方法主要目的之一在于增強CTL 反應，包括腫瘤疫苗、免疫檢查點抑制劑、過繼性T細胞療法等。腫瘤疫苗和過繼性T細胞療法是肝癌的傳統免疫療法，免疫檢查點抑制劑是針對肝癌新的免疫治療方法。

4.1 腫瘤疫苗 腫瘤抗原是一系列在腫瘤細胞中突變、異常或特異性表達的具有免疫原性的自我衍生的蛋白質，包括腫瘤相關抗原和腫瘤特異性抗原。基于腫瘤抗原的疫苗包括全裂解物疫苗、肽疫苗和樹突細胞疫苗等，全裂解物疫苗和樹突細胞疫苗作用有限，目前腫瘤疫苗開發的重點是肽疫苗。肽疫苗是基于腫瘤相關抗原的氨基酸序列，可直接刺激CTL的激活，從而識別特定的腫瘤相關抗原，殺死腫瘤相關抗原陽性的癌細胞。肽疫苗具有腫瘤特異性、毒性較小且效果持久，因此是一種有潛力的新的免疫治療方式。肝癌免疫治療成功的先決條件之一是確定在肝癌組織中具有專門或優先表達的肝癌相關抗原，并且證實這些腫瘤相關抗原的衍生表位具有強免疫原性。AKAZAWA 等［20］通過臨床試驗發現基于腫瘤相關抗原GPC3 的肽疫苗接種對晚期肝癌具有顯著抗腫瘤作用，可使肝癌患者獲得更長的生存期。δ-Catenin 肽疫苗可以刺激CTL 的激活并增強CTL 對腫瘤的浸潤，還可增強IFN-γ 的分泌和CTL 對腫瘤細胞的殺傷能力［21］。ZHANG 等［22］研究發現，人類腫瘤排斥抗原Survivin 作為一種新發現的腫瘤相關抗原，在HLA-A2 限制性存活蛋白肽脈沖T2細胞的多重刺激誘導下，來自健康供體的外周血單核細胞的存活蛋白衍生肽特異性CTL表現出對表達存活蛋白的HLA-A2+肝細胞癌細胞的特異性裂解存活。由于在我國肝細胞癌患者HLA-A2 等位基因患者比例高于其他等位基因，患者Survivin 肽表位可能是HLA-A2+肝細胞癌患者特異性免疫治療的潛在靶點。

4.2 免疫檢查點抑制劑 近年來，免疫檢查點抑制劑已成為癌癥治療中一種有前途的治療方法。免疫檢查點是一種特定的膜結合分子亞型，可作為癌癥免疫逃逸的關鍵調節劑。免疫檢查點抑制劑主要的抗腫瘤機制就是通過阻斷共抑制通路重新激活預先存在的衰竭CTL，即使在彌漫轉移的癌癥中，免疫檢查點抑制劑也可能導致長期的腫瘤消退。肝癌中研究最多的免疫檢查點包括程序性死亡蛋白1及其配體（PD-1、PD-L1）、細胞毒性T淋巴細胞蛋白4（CTLA-4）、淋巴細胞激活基因3蛋白（LAG-3）和黏蛋白包含域的分子3（Tim-3）等。肝癌TME中，PD-1和PD-L分別在CTL和肝癌細胞上大量上調。PD-1和PD-L1相互作用的阻斷可增強CTL增殖和IFN-γ分泌，還可以恢復耗竭的CTL 攻擊腫瘤的能力［23］。目前PD-1 和PD-L1 相互作用的阻斷已成為肝癌標準免疫療法的一部分。細胞毒性T 淋巴細胞蛋白4（CTLA-4）是一種抑制性共受體，由活化的T細胞表達并組成性存在于調節性T細胞上，它通過與共刺激分子CD28 競爭共享配體（CD80 和CD86）來調節T 細胞活化。在肝癌和許多其他類型的癌癥中，CTLA-4會抑制經過腫瘤相關抗原識別和分化的CTL的增殖［24］。CTLA-4阻斷在肝癌免疫治療中有重要意義。

4.3 過繼性T 細胞療法（ACT） 近年來，ACT 發展迅速，包括CAR-T、TCR-T、腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）在內的ACT 療法在血液腫瘤中意義重大，在實體瘤中的應用療效尚不確切，最主要的問題就是轉移后T細胞會衰竭和死亡。但鑒于ACT療法有潛力提供持久的抗腫瘤免疫反應，在治療肝癌的免疫療法探索和發展依然引起關注。現階段，在臨床試驗中，通過體外人工干預，CTL可以被賦予對抗腫瘤的能力，CTL通過破壞腫瘤細胞在過繼細胞療法中發揮關鍵作用。CTL過繼療法，包括基于TCR工程和基于嵌合抗原受體（CAR）的ACT療法，繞過CTL介導的抗腫瘤免疫的所有步驟，直接將活化的CTL募集到腫瘤中，具有抗腫瘤功效。TCR 基因賦予CTL腫瘤特異性反應，通過TCR基因工程修飾的CTL遇到腫瘤細胞MHC上呈遞的腫瘤抗原肽片段時，會發生基于免疫受體酪氨酸的激活基序的磷酸化，隨后發生細胞內信號級聯反應，導致CTL釋放細胞因子和細胞毒性物質，介導腫瘤細胞凋亡。相比而言，基于嵌合抗原受體（CAR）的CTL在肝癌治療中更具有臨床應用前景。如GPC3特異性CAR-T細胞就可用于治療肝細胞癌［25］，其在體外和體內均顯示出顯著抗腫瘤活性。

綜上所述，CTL 是肝癌中主要的抗腫瘤效應細胞，激發CTL 反應是肝癌抗腫瘤免疫療法的關鍵策略。目前，肝癌腫瘤疫苗的研究主要集中在開發個性化疫苗和尋找新的高表達或特異性表達的腫瘤抗原作為靶點。在目前情況下，優化肝癌免疫系統的治療潛力在于依賴不同免疫療法的組合協同增強抗腫瘤CTL 反應，此外需要特別注意的是基于CTL 的免疫療法只能作為傳統治療方法的補充，目前肝癌治療仍然首選傳統治療方法。