基于多個核基因序列的1株皮傘屬菌株的鑒定

李芳

摘要：提取在北京市房山地區野外環境中采集的1株野生菌子實體的基因組DNA，并以此為模板進行ITS、LSU和SSU片段的擴增、測序及比對分析。結果發現，從菌絲體基因組DNA中擴增獲得了700 bp左右的ITS片段、850 bp左右的LSU片段和1 800 bp左右的SSU片段，經序列測定及比對，表明該真菌是Marasmiellus屬菌株。建立了一種野生真菌快速、準確的鑒定方法。

關鍵詞：皮傘屬；分子鑒定；ITS；LSU；SSU

中圖分類號： S646.01 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0024-02

我國地域廣闊，野生食用菌資源豐富、種類繁多、分布廣泛、蘊藏量大。野生食用菌分類鑒定是涉及資源保護利用及產業發展的一項基礎性研究工作[1]。隨著分子生物學技術的廣泛應用，從分子的層面上對野生菌進行快速、有效的鑒定，為野生菌的鑒定、開發及利用提供了很大的便利[2]。本研究對北京市房山地區采集的1株野生菌進行分子鑒定，并通過多個核基因序列的測定及比對分析，從而對該野生菌株的遺傳地位進行解析，為該野生菌的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 子實體，采集自北京市房山區東湖港風景區的野生菌。

1.1.2 試劑 基因組DNA提取試劑盒Dneasy Plant Mini Kit和凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購自德國QIAgen公司；TaKaRa PCR Mix購自大連寶生物公司；瓊脂糖購自Invitrogen公司。

1.1.3 儀器 PCR儀（BIO-RAD，mycycler）、凝膠成像系統（BIO-RAD）、電泳儀（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、離心機（Eppendorf 5418）、移液器（Eppendorf）等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取少量子實體于1.5 mL離心管中，加入少量液氮，研磨棒研磨至粉末狀后，利用Dneasy Plant mini Kit試劑盒（QIAgen，貨號：69104）說明書進行DNA的提取。

1.2.2 ITS-PCR擴增 選取ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物[3]，以所提基因組DNA為模板進行PCR 擴增。擴增程序為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 7 min；降至4 ℃結束。反應體系為50 μL。然后進行電泳檢測。

1.2.3 LSU-PCR擴增

選取LR5（5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）和LROR（5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）為引物，以所提基因組DNA為模板進行PCR 擴增。擴增程序為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 60 s，30個循環；72 ℃ 10 min；降至4 ℃結束。反應體系為 50 μL。然后進行電泳檢測。

1.2.4 SSU-PCR擴增

選取NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）和NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，http：//biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm）為引物，以所提基因組DNA為模板進行PCR 擴增：95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 10 min；降至4 ℃結束。反應體系為50 μL。然后進行電泳檢測。

1.2.4 PCR產物測序及分析

PCR產物經過切膠回收后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司利用PCR擴增引物為測序引物進行測序。測序結果經過DNAMAN5.2.9和Chromas Pro軟件進行堿基修正與拼接，最終獲得的ITS、LSU和SSU序列提交到GenBank 核酸序列數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），并與數據庫中已知的相關序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

以所獲得的基因組DNA為模板，以材料與方法中所列的引物進行PCR擴增，結果如圖1所示，所得ITS產物片段大小為700 bp左右，LSU產物片段大小為850 bp左右，SSU產物片段大小為1 800 bp左右，與預期結果相一致。

2.2 序列測定及提交

上述3個PCR產物進行凝膠電泳，電泳條帶經過QIAquick Gel Extraction Kit回收后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。測序結果經過Chromas Pro軟件進行堿基修正，修正后的正向引物的測序結果和反向引物的測序結果經過DNAMAN5.2.9軟件進行拼接，最終獲得ITS序列 634 bp，LSU序列834 bp和SSU序列1 758 bp。將上述序列提交至GenBank，獲得GenBank登錄號分別為：KJ545432、KJ545433和KJ545434。

2.3 BLASTN比對分析

在NCBI網站上用BLASTN程序進行比對。ITS序列（GenBank登錄號KJ545432）的比對結果顯示，該序列與Uncultured root-associated fungus clone SC0IIc23P（FJ362110）、Uncultured Agaricales clone J2c863H（GQ924015）和Crinipellis aff. iopus JFK-2009a isolate n774（FJ167636）的相似性系數為100%，與Marasmiellus palmivorus isolate C1（JQ653443）的相似性系數為97%；LSU序列（GenBank登錄號KJ545433）的比對結果顯示，該序列與Marasmiellus palmivorus isolate C6（JQ654236）和Marasmius ruforotula voucher BRMN 714674（FJ917612）的相似性系數為100%，與Moniliophthora sp. UTC 253824（JN692483）的相似性系數為98%；而SSU序列（GenBank登錄號KJ545434）的比對結果顯示，該序列與Moniliophthora sp. MCA2500（AY916753）和Marasmius sp. MCA1708（AY916719）相似性系數為100%，與Crinipellis zonata strain OKM 25450（AY916691）的相似性系數為99%。由于SSU比對分析結果中發現目前還沒有Marasmiellus sp.序列提交，導致比對結果中沒有Marasmiellus sp.菌株的SSU序列信息。

因此綜合以上比對結果，將本研究所用的菌株鑒定為Marasmiellus sp.菌株。

3 討論

由于ITS序列比5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA更容易突變累計，被認為是在物種或物種內水平最有用的累計突變區域[4]。ITS目前已經被認為是真菌分子鑒定的條形碼[5]。但是相關研究表明，ITS對于種內的區分不是很理想，因此，有必要結合其他的序列作為輔助的條形碼，對物種進行鑒定[6]。

核糖體小亞基（small subunit，SSU）序列rRNA 基因是編碼rRNA 的基因，是高度重復串聯序列。 因此，核糖體小亞基rRNA 基因的測序與分析在物種鑒定與系統發育演化方面的應用越來越廣泛[7]。然而SSU序列較長，一般為 1 800 bp 左右，擴增所用時間較長，測序則需要3個反應才能測通獲得全長序列。

LSU核糖體大亞基（large subunit，LSU）基因組的序列是位于25～28S的RNA序列。大多數分子系統學研究中都選擇部分片段進行分析，相對比較保守[8]。本研究只采用LSU序列5′端900 bp的片段，獲得了較好的鑒定結果，因此根據本研究的結果，皮傘屬較為適合的條形碼為ITS+LSU。

參考文獻：

[1]許 峰，劉 宇，王守現，等. 一株野生大型真菌的分離與鑒定[J]. 中國農學通報，2012，28（13）：176-179.

[2]尹永剛，劉 宇，許 峰，等. 一株Agaricus屬野生菌的分離與鑒定[J]. 華北農學報，2012，27（3）：126-129.

[3]White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al. PCR protocols： a guide to methods and applications. New York： Academic Press，1990.

[4]Wang P，Liu Y，Yin Y G，et al. Diversity of microorganisms isolated from the soil sample surround Chroogomphus rutilus in the Beijing region[J]. International Journal of Biological Sciences，2011，7（2）： 209-220.

[5]Schoch C L，Seifert K A，Huhndorf S，et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer （ITS） region as a Universal DNA barcode marker for fungi[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（16）： 6241-6246.

[6]李艷春，吳 剛，楊祝良. 我國云南食用牛肝菌的DNA條形碼研究[J]. 植物分類與資源學報，2013，35（6）：725-732.

[7]Hansen Karen，Lobuglio K F，Pfister D H. Evolutionary relationships of the cup-fungus genus Peziza and Pezizaceae inferred from multiple nuclear genes： RPB2，beta-tubulin，and LSU rDNA[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2005，36（1）： 1-23.

[8]Pfister D H，Slater C，Hansen K. Chorioactidaceae： a new family in the Pezizales （Ascomycota） with four genera[J]. Mycological Research，2008，112（5）： 513-527.