13C-2H雙同位素示蹤法研究未漂硫酸鹽漿中殘余木質素的化學結構

路德勝 張 凱 陳旭東 謝益民

（湖北工業大學制漿造紙研究院，湖北武漢，430068）

制漿是造紙工業中的重要一環，其中硫酸鹽法制漿是最常用的制漿工藝。硫酸鹽法制漿過程可以去除木材中約97%的木質素[1]，但在硫酸鹽漿中仍然存在相當一部分殘余木質素，主要是由于木質素間形成的縮合結構及與多糖類物質形成的木質素-碳水化合物復合體（LCC），嚴重阻礙了木材組分的選擇性分離[2-4]。從紙漿中分離出殘余木質素，能夠更好地了解硫酸鹽制漿的脫木質素原理及殘留在紙漿中的木質素和LCC化學鍵連接的信息[1]，對制漿過程中木質素的深度去除具有重要意義[5-6]。從紙漿中分離殘余木質素一般不需要球磨，避免機械研磨造成木質素結構改變[7-8]。從紙漿中分離殘余木質素有酸水解和酶水解2 種常用方法[9]。酸水解法是利用酸催化水解多糖組分，得到硫酸鹽漿中殘余木質素，但在一定程度上會改變木質素的化學結構[10]；而酶水解法條件溫和，與磨木木質素相比木質素得率較高，分離得到的殘余物在一定程度上更能代表漿中的殘余木質素，而且由酶水解得到的木質素仍然存在5%～10%的木質素與碳水化合物相連[9-10]，可以了解漿中殘余木質素和LCC的結構信息。Terashima和Xie 等人研究發現[11-13]，通過向植物體投入帶有13C和2H同位素標記的前驅物，可以選擇性實現特定的木質素結構及糖類信號的富集，結合核磁共振技術可以得出木質素及LCC連接鍵的結合位點，進而能夠有效地斷裂木質素及LCC的連接，達到去除木質素的目的。

本研究首先向銀杏植株中投入帶13C 和2H 標記的前驅物，使之在植物體內正常轉化為帶13C 標記的木質素和帶2H 標記的碳水化合物，然后通過硫酸鹽法蒸煮除去大量木質素，對得到的硫酸鹽漿進行酶處理，獲得酶解木質素，結合固態、液態核磁共振波譜對硫酸鹽法蒸煮前后銀杏木質部的木質素及LCC 進行分析，探討蒸煮前后化學鍵的結構變化，有望為制漿過程中木質素的高效脫除提供理論依據。

1 實驗

1.1 實驗試劑及原料

實驗所用原料為6 年生銀杏植株，產地為湖北省。松伯醇葡萄糖苷-[α-13C]參考Xie 等人[12]的方法自主合成；D-葡萄糖-[6-2H2]購自Sigma 公司；羧甲氧基胺半鹽酸鹽（AOA）購自麥克林試劑公司；纖維素酶“Onozuka”RS 購自日本Yakult 株式會社；半纖維素酶（來源于黑曲霉）購自Sigma 公司；其他所需試劑均為分析純，購自國藥試劑有限公司。

1.2 銀杏植物體內前驅物的投入

在6 月4 日選取未完全木質化的銀杏植株，在其頂部主干部位進行截取，獲得直徑15～25 mm、高度30 cm，并帶有20～25 片葉子的銀杏枝條。將每根植株浸泡在200 mL 配置好的溶液中，該溶液含有松伯醇葡萄糖苷-[α-13C]300 mg，D-葡萄糖-[6-2H2]200 mg，羧甲氧基胺半鹽酸鹽8 mg。每根植株每天約吸收50 mL 溶液，4 天后每天注入50 mL 的去離子水，使得上述化學藥品在一周內吸收完畢。后期補加去離子水，在人工氣候培養箱中繼續培養3 周，保持溫度25 ℃，相對濕度50%。

1.3 銀杏木粉的硫酸鹽法蒸煮

將銀杏植株在人工氣候箱中培養1 個月，剝去外皮，從形成層向髓心方向切取新生木質部約1 mm，風干后，用Wiley 粉碎機磨至40～60 目粉末。取銀杏木粉50 g（以絕干計），按照硫化度25%、用堿量30%（以Na2O 計）、固液比1∶10 的條件，在高溫反應釜中蒸煮，溫度175 ℃，升溫1 h，保溫3 h，所得紙漿得率為50%，卡伯值為43。

1.4 未漂硫酸鹽漿中殘余木質素的分離

采用酶解法提取紙漿中的殘余木質素，先將上述同位素標記的硫酸鹽漿用PFI 磨漿機進行打漿處理，最終測得加拿大游離度為270 mL 的紙漿。稱取1 g 纖維素酶和1 g半纖維素酶加入到400 mL乙酸/乙酸鈉緩沖溶液（pH 值=4.5）中進行溶解，通過G4 砂芯漏斗過濾，濾液低溫保存。稱取未漂硫酸鹽漿24 g，均分到4個碘量瓶中，每個碘量瓶加入酶溶液100 mL，再加150 mL 緩沖溶液，然后在45 ℃下振蕩48 h，每次酶解后將2 個碘量瓶內的樣品合并，共酶解4 次，最后離心分離殘余物與溶液，殘余物用稀HCl（pH 值=2）充分洗滌，冷凍干燥。參考Lin等人[14]的方法進一步分離，將酶解后的殘余物1 用NaOH 進行抽提，用稀HCl（與水的體積比為1∶2）沉淀，再用稀HCl（pH值=2）充分洗滌，透析后分離得到堿溶性殘余酶解木質素（CEL-Alk），實驗流程如圖1所示。

圖1 未漂硫酸鹽漿的制備及殘余木質素的分離Fig.1 Preparation of unbleached kraft pulp and isolation of residual lignin

1.5 檢測方法

1.5.113C和2H豐度的測定

將培養完成后的銀杏木粉進行苯-醇（2/1，v/v）和熱水抽提，然后通過元素分析儀（FLASH 2000型）和同位素質譜儀（Delta V 型）聯用測定13C 和2H 的豐度值。通過式(2)計算13Cα/12Cα的值，式(4)計算D6/H6的值。

式(1)和式(2)中13C/12C 為樣品中13C 與12C 豐度的比值；δ13C 為樣品的C 同位素值（δ13C(VPDB)，‰）；1.11802%為標準品的13C 同位素豐度；13Cα/12Cα為樣品中木質素結構單元上Cα的13C 與12C 的同位素比值；1.0766%為不帶同位素標記的銀杏植物體內的13C 同位素豐度；0.3102為銀杏植物體內木質素的含量；10為木質素（愈創木基單元）結構中總C原子的個數與Cα位13C個數的比值。

式(3)和式(4)中D/H為樣品中D豐度與H豐度的比值；δD 為樣品中H 同位素值（δD(VSMOW)，‰）；0.015575%為標準品中D 的同位素豐度；D6/H6 為樣品中纖維素6 號位的D 與H 的同位素比值；0.013505%為銀杏植物體內D 的同位素豐度；0.45 為銀杏中纖維素的含量；5 為纖維素（葡萄糖單元）中總H的個數與6號位H的個數比值。

1.5.2 高分辨率CP/MAS13C NMR檢測

在Bruker Avance Ⅲ型600 MHz 光譜儀上，使用交叉極化（CP）和魔角自旋（MAS）對培養后的銀杏植株粉末（200 目）進行固態13C NMR 光譜測定，溫度300 K，接觸時間3 ms，脈沖遲滯2 s，每個樣品累積掃描4000次。

1.5.3 CEL-Alk的13C和1H NMR檢測

硫酸鹽漿中殘余木質素溶解在DMSO-d6中（c=130 mg/mL，用于1H 和13C NMR 實驗），在300 K 條件下，在Bruker Avance Ⅲ型600 MHz光譜儀上測定其核磁共振光譜，13C NMR 測定脈沖延遲2.5 s，采集時間0.95 s，累積掃描10000 次；1H NMR 測定循環延遲4.2 s，采集時間0.72 s，累積掃描400次?；瘜W位移參考溶劑信號δ(1H)=2.5，δ(13C)=39.5。

2 結果與討論

2.1 雙同位素標記的銀杏新生木質部的13C/2H 豐度分析

13C 和2H 的同位素豐度如表1所示，經13C/2H 標記后的銀杏木質部同位素比值都有較明顯的提高，其中13Cα/12Cα值為未標記物的3.2 倍，D6/H6 值比未標記高13倍，表明人工投入的13C和2H 標記的前驅物在植物體內成功得到了轉化，未影響植物的正常生長，為后續實驗奠定了基礎。

表1 銀杏木粉的13C/2H豐度Table 1 13C/2H abundance of ginkgo wood mill

2.213C/2H 雙同位素標記的銀杏木粉的固態CP/MAS13C NMR分析

高分辨率CP/MAS13C NMR 核磁共振譜可以對難溶性大分子物質進行全組分無損分析，對結構研究具有一定的參考價值[15-17]。但是在核磁共振測定過程中，固體分子之間不能自由運動，自旋耦合較強，導致吸收峰較寬，掩蓋了一些信號。由13Cα標記物與未標記物得到Cα增強信號的差示譜圖（圖2，以δ=55.8 處甲氧基的吸收峰為基準），能夠從很大程度上彌補CP/MAS13C NMR 譜的不足，同時也證實了松伯醇葡萄糖苷-[α-13C]在銀杏植物體內的成功轉化。在差示譜圖中，盡管δ在50～110范圍內不可避免地會有殘余的多糖信號，但在低場區域（δ＞160）和高場區域（δ＜50）均未發現明顯的吸收峰，基線較為平坦，認為殘留的多糖信號對此貢獻很少。由圖2可以明顯看到有關Cα的增強信號，在δ=134.0 處（No.3）顯示的是松伯醇結構中—Cα==C—的信號[18]。δ=105.6 處（No.4）是木質素結構單元與多糖類物質以縮醛鍵連接的Cα信號[19]，原本裸子植物的木質部中存在一定量的縮醛鍵LCC 結構?；瘜W位移δ=90.1 處（No.5）Cα的信號歸屬于G 型木質素單元間苯基香豆滿結構[20]。δ=84.2（No.6）信號是與多糖類物質以苯甲醚鍵連接的木質素結構中的Cα[21]。δ=75.5（No.7）處的增強信號可能來自與苯甲酯鍵型LCC 結構以及β—1 縮合型結構的Cα信號。δ=72.9（No.8）處的增強信號最為明顯，表明原木質素單元間存在大量的β—O—4結構，證實了β—O—4結構是木質素單元間主要的連接結構，這與前人的研究結果一致[19]。δ=63.0（No.10）處的增強信號表明天然銀杏植株中存在β—1 型木質素單元間結構[22]。

圖2 銀杏木粉的CP/MAS13C NMR譜圖及其差示譜圖Fig.2 CP/MAS13C NMR and difference spectra of ginkgo wood mill

2.3 CEL-Alk的13C NMR分析

使用纖維素酶和半纖維素酶對硫酸鹽法蒸煮后的漿料進行酶解處理，降解掉大部分多糖組分，減少糖組分在核磁共振測試中的信號。對硫酸鹽法蒸煮后CEL-Alk中堿溶木質素部分進行了13C NMR 光譜表征，根據參考文獻[19]，將δ=55.8處甲氧基的信號峰作為基準峰，對比結果如圖3所示。具體的13C化學位移歸屬見表3，主要的木質素和LCC連接結構如圖5所示。

表3 CEL-Alk的13C NMR化學位移及信號歸屬Table 3 13C NMR chemical shifts and signal assignments of CEL-Alk

圖3 銀杏CEL-Alk的13C NMR譜圖Fig.3 13C NMR spectra of ginkgo biloba CEL-Alk

通過圖3發現，在化學位移δ=147.4（No.7）處顯示的是愈創木基C4[23]以及肉桂酸中的Cα吸收峰[24]，α-13C標記產物在此處有較明顯的增強，表明木質素在硫酸鹽法蒸煮過程中部分碎解，產生了較多的肉桂酸結構。在化學位移δ=129.8（No.8）處的振動信號是由愈創木基C1[24]，松伯醇中的Cα和Cβ[13]，以及少量對-香豆醇中的C2 和C6 引起的[12]，α-13C 標記后有明顯的增強，表明在硫酸鹽法蒸煮過程中與木質素結構單元α位碳原子連接的醚鍵、酯鍵發生了斷裂，形成了較多的—Cα==Cβ—，13C標記的產物的Cα信號的增強較為明顯?；瘜W位移δ=102.1（No.13）處是與糖單元有縮醛鍵連接的Cα，聚木糖、甘露糖以及苯基糖苷上的C1 產生的吸收峰[25-26]，α-13C 標記的殘余CEL-Alk 在此處信號有明顯增強，表明硫酸鹽漿殘余木質素中有一小部分是木質素Cα與多糖以縮醛鍵連接的，而連接的糖的類型很有可能是聚木糖[19]，說明具有縮醛鍵的LCC結構在硫酸鹽法制漿過程中比較穩定。在δ=97.1（No.14）處顯示的是苯基糖苷區域[27]，一般是木質素的酚羥基與多糖還原端羥基形成苯基糖苷鍵[5,8]，而葡甘聚糖在堿性高溫條件下容易降解，聚木糖則相當穩定[28]，認為此共振信號是木質素與聚木糖連接形成的糖苷鍵?；瘜W位移δ=80.6（No.15）處的增強信號為木質素單元Cα與碳水化合物形成的苯甲醚鍵結構[29-30]，而硫酸鹽法蒸煮后紙漿中碳水化合物主要是甘露糖和木糖[31]，所以此位置可能是木質素Cα與甘露糖C6位的連接，也可能是木質素Cα與聚木糖C2或C3位的連接[32]。

化學位移δ=75.8（No.16）處，在未標記的CELAlk核磁譜圖上未發現明顯的信號峰，而在α-13C標記物中能看到明顯的增強信號，這就排除了木糖、甘露糖和葡萄糖對此信號的貢獻，確定是來自木質素單元β—O—4（蘇型）結構中Cα信號[26]，表明非酚型β—O—4 型木質素在堿法制漿中具有一定的穩定性，在硫酸鹽法蒸煮后仍然有部分存在。δ=72.5（No.17）處的共振信號是由β—O—4（赤型）結構中的Cα[23-25]，甘露糖和β-葡萄糖上的C2、C3，以及聚木糖上的C2，β—β結構中的Cγ也會在此處產生共振信號[33]，但在未標記樣品的譜圖上沒有發現信號峰，證明是由蒸煮后殘余的非酚型β—O—4 結構中的Cα共振引起的。在δ=67.3（No.18）處的信號峰是由Ar—CHOH—CH3結構中的Cα引起的[25]，表明在硫酸鹽法蒸煮后，CEL-Alk殘留著部分帶α—OH的芳基片段，Cγ位產生甲基，而蒸煮及酶解過程會不同程度地破壞糖類結構，導致α,β-甘露糖C4，β-木糖C5 在此處的信號消失。在化學位移δ=63.16（No.20）處，帶α-13C標記的CEL-Alk 與未標記的CEL-Alk 相比，信號峰有較為明顯的提高，表明此信號是由硫酸鹽法蒸煮過程中β—1縮合型結構Cα產生的[26,34]，說明β—1縮合型結構在硫酸鹽法制漿過程中比較穩定。在δ=25～50之間存在大量的甲基和亞甲基的碳信號，這是由于在硫酸鹽法制漿過程中酚型及非酚型的α-醚鍵、β-醚鍵的斷裂，導致木質素結構單元產生大量的甲基和亞甲基結構。

2.4 CEL-Alk的1H NMR分析

1H NMR 的共振信號較寬且重疊，測出的譜圖較粗鈍[35]，六碳糖的C6 位經過2H 同位素標記后，相關的信號會減弱，采用差示譜圖進行處理，可以使減弱的信號顯露出來[21]。經酶處理后漿料中沒有LCC 連接鍵的大量多糖類物質被水解掉，通過差示譜圖可以更加清晰地看到木質素與多糖之間的連接，以芳香質子為基準，2H 標記的CEL-Alk 和未標記的CEL-Alk 的差示譜圖如圖4所示。

圖4 銀杏CEL-Alk的1H NMR差示譜圖（未標記的譜圖減去2H標記的譜圖）Fig.4 1H NMR difference spectra of ginkgo CEL-Alk(unlabeled spectra minus2H labeled spectra)

由圖4 可知，除了乙?；屑谆墓舱裥盘柾?，幾乎所有的共振信號都出現在δ在3.0～5.5之間?；瘜W位移δ在4.78～4.70（No.2）和δ在4.68～4.53（No.3）處顯示的是葡萄糖單元C6 上的D 信號[21]，為木質素單元Cα位與葡萄糖單元上伯羥基形成的苯甲醚鍵結構，在No.3 處可能還存在甘露糖C6 上的D 信號，顯示為木質素Cα與葡萄糖或甘露糖C6 的苯甲醚鍵連接[36-37]，說明硫酸鹽漿中殘留的木質素-多糖復合體苯甲醚鍵結構較穩定，這與Taneda等人[38]的研究結果基本一致。化學位移δ在3.82～3.72（No.4）吸收區域中有葡萄糖單元C6 上D 的貢獻，可能是纖維素（未取代）6-D 和6-D’的共振信號[21]，說明酶降解后的殘余木質素中還含有少量的纖維素組分。由CEL-Alk的1H NMR 差示譜圖可以得出，硫酸鹽漿中木質素與多糖之間存在苯甲醚鍵連接。詳細的1H NMR 信號歸屬如表4所示，殘余的木質素及LCC結構見圖5。

表4 CEL-Alk的1H NMR差示譜圖的化學位移及信號歸屬Table 4 Chemical shifts and signal assignments of1H NMR difference spectra of CEL-Alk

圖5 銀杏材硫酸鹽法制漿后殘余木質素及LCC結構Fig.5 Residual lignin and LCC structure of ginkgo wood after kraft pulping

3 結論

將松柏醇葡萄糖苷-[α-13C]和D-葡萄糖-[6-2H2]及阻詰劑AOA 投入生長的銀杏植株中。培養一個月后，新生木質部的13C/2H 豐度顯示木質素及聚糖分別被13C和2H 所標記。對雙同位素標記的木粉進行硫酸鹽法蒸煮，采用酶水解法分離得到漿中的纖維素酶解木質素（CEL），再利用堿抽提從殘余木質素中獲得堿溶性CEL（CEL-Alk）。

3.1 由13C/2H 雙同位素標記的銀杏木粉的固態CP/MAS13C NMR 光譜可知，天然銀杏木質部中木質素結構單元間主要以β—1、β—5、β—O—4連接，少量木質素單元Cα與多糖類物質以苯甲醚鍵和縮醛鍵連接。

3.213C/2H 雙同位素標記的CEL-Alk 的13C NMR 分析結果表明，銀杏木粉經硫酸鹽法蒸煮后殘余木質素主要是β—5、β—1 等縮合結構，部分木質素通過縮醛鍵與多糖類物質相連。

3.313C/2H 雙同位素標記的CEL-Alk 的1H NMR 差示譜圖顯示出木質素單元Cα與葡萄糖或甘露糖形成的苯甲醚鍵結構，表明苯甲醚鍵結構在硫酸鹽法蒸煮過程中較穩定。