非小細胞肺癌中circ-SOX4 調控起始細胞干性并通過Wnt 通路促進腫瘤進展的機制探討

蔣騫 張雅坤 侯維 趙妍麗 賈婷婷

非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的80%,是肺癌病理診斷中最普遍的組織學類型。這個病理類型可進一步分為兩個主要亞型,即：腺癌(LUAD)和鱗狀細胞癌(LUSC)［1］。手術、放化療是NSCLC 主要治療手段,雖然相關分子靶向和免疫治療取得了進展,但晚期NSCLC 患者的預后仍然很差［2］。因此,研究NSCLC演進的潛在分子機制,為治療尋找更多有效靶點具有重要的臨床意義。

腫瘤干細胞也稱為腫瘤起始細胞(TICs),一直被認為是腫瘤難以消除的主要原因［3］。目前的治療只針對大多數腫瘤細胞,而不能根除TICs,所以殘留的TICs可導致治療后腫瘤復發［4］。包括利用細胞表面標記物CD133 在內的幾種方法已經被用來識別肺癌中的TICs［5］。在過去的幾年中,乙醛脫氫酶1(ALDH1)+癌細胞由于其在自我更新、增殖和體內腫瘤形成方面的潛在能力而被定性為TICs［6］。研究TICs 的分子調控異常有助于進一步了解肺腫瘤生物學。更重要的是,研究TICs 相關的分子機制可能為尋找NSCLC 的治療靶點提供依據。

環狀RNA(circRNA)為具有閉環的非編碼RNA 的一種亞型,與傳統的線性RNA 明顯不同［7］。在人類腫瘤發生發展中,circRNA 的多種調控作用(包括作為分子海綿吸附miRNA 或蛋白、編碼多肽等)已引起人們廣泛關注［8］。相關研究例如：環狀RNA hsa_cic_0052112 通過吸附miR-125a-5p 促進乳腺癌細胞轉移［9］,環狀RNA hsa_circ_0001313 與結腸癌細胞的放射敏感性有關［10］,環狀RNA hsa_circ_0000144 通過靶向miR-217/RUNX2 軸調節膀胱癌的進展［11］。此外,越來越多的證據也證實了circRNA 在NSCLC 進展中的關鍵作用。例如：環狀RNA hsa_circ_0078767 通過吸附miR-330-3p 調節RASSF1A 的表達,從而影響NSCLC 的進 展［12］。環 狀RNA hsa_circ_0004015 通過靶 向miR-1183/PDPK1通路調節NSCLC的進展［13］。環狀RNA hsa_circ_0008305 通過調節轉錄中介因子1γ(TIF1γ)抑制了轉化生長因子-β(TGF-β)誘導的NSCLC上皮-間質轉化和轉移［14］。而hsa_circ_0131457(circ-SOX4)為一種新的環狀RNA,其對腫瘤的調控作用尚不清楚。本研究為首次探討circ-SOX4 表達與肺TICs 干性的關系以及其促進NSCLC 進展的機制,這將為NSCLC 防治提供新的探索思路。

1 材料與方法

1.1 試劑 NSCLC 細胞(A549,H1299,H1792,H226,H522,H1944,Calu-1 和H460)購自美國模式培養物集存 庫(ATCC) (Manassas,VA,USA)；CCK-8 及Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗體anti-Oct4、anti-Nanog、anti-SoX2、anti-Sox4、anti-GAPDH 均購自Abcam (Cambridge,USA)；抑制 劑RO4929097、LY294002、CHS828 和KYA1797 k購自Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)；表面標記物CD133 購自 Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach,Germany)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 將細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養基,在37 ℃、5% CO2條件下進行培養。sh-circ-SOX4#1/2及其陰性對照shNCs 由Genechem(Shanghai,China)構建。circ-SOX4 過表達質粒和空pcDNA3.1 載體由ZonHon Biopharma Institute(Changzhou,Jiangsu,China) 構建。6 孔板細胞培養1 d,用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染,48h后收獲細胞。

1.2.2 定量聚合酶鏈反應 使用TRizol Reagent(Takara,Tokyo,Japan) 提取細胞總RNA,合成cDNA。采用SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems,Waltham,MA,USA) 在Bio-Rad (Bio-Rad,Hercules,CA,USA) 上進行qRT-PCR。相對表達歸一化至GAPDH,采用2-ΔΔCt方法測定表達量比值。

1.2.3 CCK-8 和平板克隆形成實驗 轉染后的細胞按1×105/孔的數量接種于96 孔板中并培養,用CCK-8 試劑盒檢測細胞在不同時間點(0、24、48、72、96 h)的增殖情況,通過分光光度板閱讀器(Olympus,Tokyo,Japan)監測450 nm 的吸光度。克隆形成實驗中,將細胞按7×102/孔的數量接種于6 孔板中。培養14 d 后,固定細胞并染色,人工計數形成的克隆細胞 (≥50 個細胞)。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 將轉染細胞接種于6 孔板中并培養,然后用冷磷酸鹽緩沖液沖洗2 次,再重懸細胞。隨后使用冰乙醇固定上述細胞1 h。最后使用Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒染色,并通過流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)檢測細胞凋亡。

1.2.5 Western blotting 用RIPA 緩沖液(Invitrogen)裂解細胞并提取總蛋白質,經SDS-PAGE 電泳分離蛋白,然后轉移到PVDF (Bio-Rad)。在室溫下,用5%脫脂奶粉封閉2 h 后,TBST 緩沖液洗膜3 次,再與相應一抗孵育過夜。次日將膜與羊抗兔抗體(1∶4000)或羊抗鼠二抗(1∶8000)在室溫下孵育1 h,隨后加入化學發光底物(Bio-Rad),最后使用ImageQuant LAS4000 成像分析儀(GE,USA)檢測。由Image J 軟件分析蛋白質的相對表達量。

1.3 統計學方法 所有實驗均獨立進行3 次。數據以均數±標準差()表示,并通過GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)和SPSS 19.0(SPSS,Chicago,IL,USA)軟件進行分析。差異分析采用ANOV A 或Student's t-test。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 circ-SOX4 在肺TICs 中表達顯著上調并與TICs干性相關 查詢在線數據庫(http://cgga.org.cn:9091/circRNADisease/),獲得NSCLC 原發腫瘤的circRNA 表達信息,并按ALDH1+和ALDH1-進行分類比較。結果顯示：在ALDH1+腫瘤細胞中,hsa_circ_0000497、hsa_circ_0018082、hsa_circ_0024105、hsa_circ_0044360 及hsa_circ_0131457 表達顯著上調。見圖1A。

采用流式細胞術將肺癌細胞(A549、H1299、H1792、H226、H522、H1944、Calu-1 及H460) 按CD133+及CD133-進行篩選分類。qRT-PCR 檢測結果顯示：相較于CD133-肺癌細胞,hsa_circ_0131457(circ-SOX4)在CD133+細胞中的表達顯著上調,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見圖1B。

與陰性對照相比,過表達circ-SOX4 使CD133-H-1944/Calu-1 細胞中CD133 表達顯著上調,而敲減circ-SOX 則顯著下調CD133+細胞中CD133 表達,差異均具有統計學意義(P＜0.01)。見圖1C。

圖1 circ-SOX4 在NSCLC 中的表達及與TICS 干性關系

2.2 下調circ-SOX4 抑制肺TICs 的增殖、促進其凋亡 與陰性對照相比,敲減circ-SOX4 能顯著抑制體外培養48、72、96 h 時CD133+H-1944/Calu-1 細胞的增殖,減少CD133+H-1944/Calu-1 細胞的克隆形成,增加CD133+H-1944/Calu-1 細胞的凋亡,下調干性基因OCT4、Nanog、SOX2 和SOX4 的表達,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見圖2A,2B,2C,2D。

圖2 下調circ-SOX4 對肺TICs 增殖、凋亡及干性的影響

2.3 circ-SOX4 通過Wnt 通路促進肺癌進展 與陰性對照相比,過表達circ-SOX4 能顯著促進體外培養48、72、96 h 時CD133-Calu-1 細胞的增殖,增加CD133-Calu-1 細胞克隆形成,抑制CD133-Calu-1 細胞凋亡,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。Wnt 通路抑制劑KYA1797 k 可逆轉過表達circ-SOX4 對上述細胞的影響。相較于單純過表達circ-SOX4,過表達circ-SOX4聯合KYA1797 k 能顯著抑制體外培養48、72 和96 h時CD133-Calu-1 細胞的增殖,減少CD133-Calu-1細胞克隆形成,并增加CD133-Calu-1 細胞凋亡,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。而RO4929097(Notch通路抑制劑)、LY294002(PI3K/AKT 通路抑制劑)和CHS828(NF-κB 通路抑制劑)對上述轉染細胞的增殖和凋亡無顯著影響,差異均無統計學意義(P＞0.05)。見圖3A,3B,3C。

圖3 上調circ-SOX4 后,Wnt 等通路抑制劑對肺TICs 增殖及凋亡的影響

3 討論

目前,NSCLC 的主要治療方法包括手術、放化療、靶向及免疫治療。由于上述治療并非特異針對TICs,其殘留成為腫瘤復發的重要因素［4］。多項研究闡明了環狀RNA 在乳腺癌、結腸癌和膀胱癌中的關鍵調控作用［9-11］。因此,需要以肺癌TICs 為研究NSCLC 進展的切入點,鑒定在肺癌TICs 中差異表達的circRNAs,并進一步研究其生物作用。本研究篩選出在NSCLC 起始細胞中表達上調的circ-SOX4,驗證其與TICs 干性正相關。并通過功能實驗證實circ-SOX4 能促進TICs 細胞增殖,正向調控其干性,抑制其凋亡。上述研究說明,circ-SOX4 是NSCLC 進展中的重要癌基因。

越來越多的證據表明,Wnt 通路在多種腫瘤中發揮重要作用。例如,Wnt 途徑的蛋白質可用作膠質母細胞瘤中調節CD133+癌癥干細胞的靶標［15］。RHBDD1通過Wnt 途徑和對ZEB1 的調節促進結直腸癌的細胞轉移［16］。在本研究中,探討了Wnt 通路在circ-SOX4促進NSCLC 進展中的作用。功能實驗證實circ-SOX4通過Wnt 通路促進肺癌增殖,并抑制肺癌凋亡。由此說明Wnt 通路在NSCLC 進展中發揮了正向調節作用,但Wnt 通路是如何激活,以及通路相關的上下游調控機制尚待進一步研究明確。

綜上所述,在NSCLC 起始細胞中表達上調的circ-SOX4 能正向調控TICs 干性,并通過Wnt 通路促NSCLC 增殖,抑制其凋亡。因此,對circ-SOX4 及Wnt通路調控TICs 機制的研究將為NSCLC 防治提供新的思路。