牛結(jié)核病病原診斷檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

楊曉霞，孫桂珍，王兆麗

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，山東 泰安 271018；2.山東省泰安市中心醫(yī)院醫(yī)聯(lián)體辦公室，山東 泰安）

牛結(jié)核病在我國(guó)被劃歸為動(dòng)物疾病中的二類(lèi)，其病原細(xì)菌為分枝桿菌，屬于歸革蘭氏陽(yáng)菌。從發(fā)現(xiàn)結(jié)核病的病原至今已有 130多年的歷史，經(jīng)過(guò)多年的努力該病曾得到一定的控制，但近年來(lái)隨著養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，家畜及人類(lèi)結(jié)核病陽(yáng)性率又有上升趨勢(shì)，仍然是威脅動(dòng)物與人類(lèi)健康的重要傳染病之一。本文通過(guò)總結(jié)牛結(jié)核病流行的現(xiàn)狀，從流行病學(xué)及病原診斷檢測(cè)技術(shù)方面進(jìn)行探討，從而對(duì)牛結(jié)核病的防疫提供技術(shù)支撐。

1 牛結(jié)核病流行現(xiàn)狀

牛結(jié)核病發(fā)生的原因是牛感染了兩種細(xì)菌：一是結(jié)核分枝桿菌、二是牛分支桿菌[1]。感染了牛結(jié)核病的畜類(lèi)會(huì)將這種疾病傳染到其他動(dòng)物，甚至是人的身上。從頻發(fā)的感染區(qū)域來(lái)分析，農(nóng)村地區(qū)為該疾病暴發(fā)的主要場(chǎng)所。此外，結(jié)核病加重的原因還與用藥不當(dāng)有關(guān)，錯(cuò)誤地用藥會(huì)導(dǎo)致結(jié)核病菌產(chǎn)生耐藥菌株，導(dǎo)致藥效下降[1-2]。

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，每年在世界范圍內(nèi)感染結(jié)核病的人數(shù)接近 1 000萬(wàn)，其中三成的人最終會(huì)死于結(jié)核病[3]。因此，世界衛(wèi)生組織對(duì)此保持高度關(guān)注，并提出要在全世界范圍內(nèi)防治結(jié)核病[3-4]。通過(guò)對(duì)牛結(jié)核病流行地的患病樣本進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示，其主要病原菌為結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌兩種，分別占比分別 85 % 和15 %。時(shí)至今日，還尚未有有效的牛結(jié)核病特效疫苗。

2 牛結(jié)核病流行病學(xué)研究

當(dāng)今，牛結(jié)核病廣泛流行在整個(gè)世界范圍內(nèi)，北美洲、大洋洲、東亞以及不列顛群島都有分布。有研究結(jié)果顯示，在美國(guó)的養(yǎng)殖場(chǎng)中，感染牛結(jié)核病的養(yǎng)殖場(chǎng)大概占總數(shù)的 22%，并且奶牛受到牛結(jié)核病的影響較為嚴(yán)重，產(chǎn)奶量將受到嚴(yán)重的影響[5]。我國(guó)的牛結(jié)核病首次確診于上世紀(jì)的 50年代中期，發(fā)生的地點(diǎn)在內(nèi)蒙古。此后，牛結(jié)核病在我國(guó)多個(gè)地區(qū)和省份傳播，并且以北方地區(qū)為主，這與北方地區(qū)畜牧業(yè)占比大存在直接關(guān)系。在所有感染結(jié)核病的動(dòng)物中，牛類(lèi)的感染幾率最大。有研究表明，牛在散養(yǎng)的狀態(tài)下，感染結(jié)核病的幾率不會(huì)超過(guò) 5 %，但在圈養(yǎng)狀態(tài)下，由于牛群較為集中，一旦發(fā)生飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)默F(xiàn)象就會(huì)導(dǎo)致病菌搭載在飼料、飲水和空氣中傳播到牛中[6]。感染結(jié)核病的奶牛產(chǎn)出的乳汁也會(huì)攜帶病菌，乳汁接觸到空氣，其中的病菌也會(huì)借助空氣傳播。人感染結(jié)核病主要原因是飲用了沒(méi)有經(jīng)過(guò)完全消毒處理的乳制品[7-8]。

3 牛結(jié)核病病原檢測(cè)技術(shù)

3.1 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

在細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的過(guò)程中，需要將患病動(dòng)物的體液盡可能收集完整，為開(kāi)展Ziehl-Neelsen氏抗酸桿菌的染色實(shí)驗(yàn)提供必要的實(shí)驗(yàn)材料。如果染色后呈現(xiàn)紅色，那么就需要將實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行酸堿處理，置于羅杰二氏的培養(yǎng)基進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，觀察菌落的狀態(tài)及診斷。值得注意的是，細(xì)菌學(xué)檢測(cè)只適用于診斷開(kāi)放性的結(jié)核病，由于在培養(yǎng)細(xì)菌的過(guò)程中容易接觸到活菌，通常不推薦使用這種方法[9-10]。

3.2 結(jié)核菌素檢測(cè)

從病原學(xué)角度檢測(cè)牛結(jié)核病的主要方法是結(jié)核菌素檢測(cè)，這種方法的最大優(yōu)勢(shì)就在于簡(jiǎn)單易操作、安全可靠、容易進(jìn)行判斷等。該檢測(cè)方法的具體內(nèi)容為：在牛頸部的 1/3處的位置進(jìn)行皮下注射，注射的藥劑為10萬(wàn)IU/ml的結(jié)核菌素，劑量為0.1 ml，在注射完畢72 h之后，測(cè)量牛皮膚的厚度，以厚度為判斷的主要標(biāo)準(zhǔn)。但是，這種檢測(cè)方法也有局限性，即面對(duì)潛伏性或者隱性的感染束手無(wú)策[11-12]。

3.3 全血刺激干擾素釋放檢測(cè)

全血刺激干擾素釋放檢測(cè)的具體方法為：選用特異抗原刺激感染的病牛，提取其外周血淋巴細(xì)胞并在體外培養(yǎng) 24 h，對(duì)其產(chǎn)生的 IFN-γ進(jìn)行檢測(cè)，從而確診是否有牛結(jié)核病病原。備選的特異抗原有兩種：分別為PPD-A和B。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以判定感染牛結(jié)核的病菌屬于哪種類(lèi)型，并可以用作上述結(jié)核菌素檢測(cè)的一種補(bǔ)充。但血刺激干擾素釋放檢測(cè)方法成本較高，因此該方法暫時(shí)無(wú)法滿足小型牧場(chǎng)的需求[13-14]。

3.4 血清學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)檢測(cè)的是對(duì)血液中抗原和抗體的檢測(cè)，目前最普遍的方法就是酶聯(lián)免疫吸附法。在結(jié)核病檢驗(yàn)的過(guò)程中，通過(guò)固定特異性的抗原來(lái)檢測(cè)血清特異的抗體。血清學(xué)檢測(cè)方法與上述的全血刺激干擾素釋放檢測(cè)相比，在操作過(guò)程中更為簡(jiǎn)便，并且可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，在成本上也無(wú)需承受過(guò)多的負(fù)擔(dān)，但傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)的特異性較低，需要選擇特異性較好的抗原來(lái)優(yōu)化[15-16]。

3.5 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)這種技術(shù)建立在ELISA原理之上，該技術(shù)檢測(cè)的對(duì)象為分泌細(xì)胞因子的免疫細(xì)胞。在判斷機(jī)體是否受結(jié)核分枝桿菌感染的過(guò)程中，采用了具有分枝桿菌特異性的抗原。這種檢測(cè)方法與上述的結(jié)核菌素檢測(cè)相比，在敏感性上有了突出的提升，并且在特異性上也有了較大的進(jìn)步[17-18]。

4 討論

當(dāng)前，牛結(jié)核病并沒(méi)有特效的治療方法，只能依賴(lài)于將患有結(jié)核病的陽(yáng)性個(gè)體盡早淘汰。而牛結(jié)核病的顯著特點(diǎn)之一就是具有較長(zhǎng)的潛伏時(shí)間，因此，牛結(jié)核病的快速精準(zhǔn)診斷就顯得尤為重要[19-21]。本文通過(guò)總結(jié)牛結(jié)核病流行的現(xiàn)狀，從流行病學(xué)及病原診斷檢測(cè)技術(shù)方面進(jìn)行探討發(fā)現(xiàn)，目前單一使用任何一種方法都難以完成牛結(jié)核病的診斷，因此在臨床中除了應(yīng)用上述病原學(xué)檢測(cè)方法外，還應(yīng)聯(lián)合使用免疫學(xué)方法以及分子生物學(xué)方法進(jìn)行輔助診斷。通過(guò)多種途徑，采取多種方法對(duì)種群的狀態(tài)進(jìn)行定期檢測(cè)，測(cè)驗(yàn)出的陽(yáng)性牛在第一時(shí)間淘汰出去，從而將牛結(jié)核病控制在最小的范圍內(nèi)。