豬口蹄疫診斷技術

張麗娜

（安徽省淮南市壽縣動物疫病預防與控制中心 232200）

豬口蹄疫的治療很難，而且還會在短時間內迅速地蔓延擴散，因此必須要重視起診斷技術的應用，以便可以及時確診并采取針對性的治療辦法，從而降低經(jīng)濟損失。

1 豬口蹄疫

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，在其傳播過程中，豬主要是口蹄疫發(fā)生的放大器，其能夠促進口蹄疫的傳播，擴大傳播范圍，造成嚴重的負面影響。就當前的獸醫(yī)臨床實踐中可以發(fā)現(xiàn)，病豬往往發(fā)病較快、較急，大多數(shù)病豬會突然高燒（高達41℃左右），且精神不佳，食欲廢絕，可以觀察到在豬的口鼻部、蹄冠部、蹄叉部及口腔黏膜和乳頭皮膚上會出現(xiàn)許多小水泡，隨著病情的發(fā)展，水泡會發(fā)生潰爛，極易引起繼發(fā)感染，比如仔豬會因病發(fā)腸炎和心肌炎而死亡。

通過對口蹄疫病毒進行分析可以發(fā)現(xiàn)，其主要分為O型、A型、C型、Asia-1、STA1、STA2和SAT3等7個血清型，目前、世界各地豬群中以O型、A型為主，其中亞洲國家主要以O型、A型、Asia1等為主，而我國主要流行毒株有A型ASIA拓撲型Sea-97毒株、O型SEA拓撲型Mya98毒株和O型ME-SA拓撲型PanAsia毒株。由此可見，導致豬口蹄疫的病毒株具有較大差異，簡單的臨床治療辦法很難起到效果，必須要準確診斷血清型，并全面監(jiān)測其隱性帶毒的情況，從而為該病的防控奠定良好的基礎[1]。

2 豬口蹄疫診斷技術

2.1 血清學診斷

2.1.1 補體結合試驗（CFT）

補體結合試驗最早出現(xiàn)于1952年，其在實際應用中能夠將已知的抗原、被檢抗體為檢測系統(tǒng)組，與紅細胞、溶血素指示系統(tǒng)組進行競爭補體，兩者如果發(fā)生溶血，則為陰性，反之則為陽性，該方法在診斷口蹄疫病毒上比較直觀，但是在實際操作中需要試驗人員嚴格把握補體的使用量，因此該方法不能用于快速檢測中，目前在豬口蹄疫的診斷上也降低了應用概率。

2.1.2 病毒中和試驗（VNT）

病毒中和試驗一般常用于進出境動物口蹄疫病毒感染的檢測工作中，效果較好，在保護進出口安全上發(fā)揮著重要的作用。但是這一方法在應用過程中需要實驗室進行單層細胞的培養(yǎng)工作，或者是飼養(yǎng)試驗動物，而且進行體外檢測的時候還會因為細胞生長狀態(tài)、病毒敏感性的變化等受到一定的影響，且必須要使用或病毒才能夠進行有效的檢測，對實驗室的要求也比較高，因此一般不用于基層的口蹄疫診斷中。

2.1.3 間接血疑試驗（IHA）

間接血疑試驗在實際應用中可以有效地檢測血清中的抗體和抗原水平，檢測結果較為直觀，在操作上也比較簡單，還能夠實現(xiàn)定量與定性檢測，因此是當前臨床中常用的一種檢測辦法。其在實際應用中需要將口蹄疫病毒吸附在綿羊紅細胞載體上，以此可以形成致敏紅細胞，其在電解質環(huán)境下可以與檢測樣本中的抗體相遇且發(fā)生凝集反應，因此可以直接使用肉眼進行觀察[2]。

2.2 分子生物學診斷

2.2.1 熒光定量（PCR）

熒光定量既可檢測病毒核酸又可檢測病毒的血清型，還能夠實現(xiàn)定量檢測，因此在口蹄疫臨床樣品診斷中發(fā)揮重要的作用，已經(jīng)成為我國蹄疫病毒快速檢測的標準方法。

2.2.2 基因芯片技術（DNAchips）

基因芯片技術靈敏度相對常規(guī)RT-PCR來說更高，實驗表明可以高10～100倍，而且芯片保存3個月仍能重復使用，大大節(jié)省了檢測成本。在實際應用中，基因芯片技術能夠快速且準確地檢測口蹄疫病毒，確定其血清型與基因型，還能夠幫助防控人員區(qū)分免疫動物與自然感染動物。但是其需要進行樣品制備，成本較高，因此在基層普檢中還沒有得到推廣。

2.2.3 生物傳感器技術

生物傳感器技術是生物科學發(fā)展過程中誕生的一種新技術，其涉及到生物、化學、物理、醫(yī)學、電子技術等多種學科，當前主要應用于環(huán)境監(jiān)測、食品、醫(yī)學診斷等領域，在實際應用中表現(xiàn)出選擇性好、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)勢，而且在電子技術等先進技術的支持下，生物傳感器技術還能夠實現(xiàn)在線監(jiān)測，且自動化、微型化與集成化特點較為明顯。在動物疫病的診斷中，生物傳感器技術主要應用于口蹄疫病毒、皰疹病毒及彎曲桿菌等的檢測中，比如在口蹄疫的診斷上，其主要是通過壓電免疫傳感器進行檢測，比如當前常見的壓電（PZ）晶體的免疫生物傳感器，能夠特異性地用于口蹄疫病毒的分型，因此診斷效果較好，在當前的口蹄疫診斷中應用比較廣泛。

3 豬口蹄疫診斷技術的發(fā)展

3.1 膠體金免疫層析快速診斷技術

膠體金免疫層析快速診斷技術在實際應用中主要是將已知抗原或抗體用膠體金進行標記，之后可以通過抗原抗體特異性結合反應使得膠體金集聚形成肉眼可見的形式，以此來實現(xiàn)檢測工作。而且其在實際應用中不需要特殊的設備和專業(yè)人員，不僅操作簡單，而且反應靈敏，能夠快讀的監(jiān)測血清型O、A或Asia1。在當前的口蹄疫診斷中，可以制作口蹄疫Asia1型的可定量檢測的膠體金試紙，其特異性與敏感性都比較好，在定量檢測中發(fā)揮著重要的作用。

3.2 逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術（RT-LAMP）

逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術在實際應用可以直接采用瓊脂糖凝膠電泳、顏色變化、生成的沉淀等現(xiàn)象判定反應結果，因此表現(xiàn)出操作簡單、靈敏度高的優(yōu)勢，檢測后也不需要借助特殊設備，只需要肉眼就能夠觀看到檢測結果，且實驗結果表明該方法從核酸提取到檢測僅需要75min[3]。

3.3 重組酶聚合酶擴增技術（RPA）

重組酶聚合酶擴增技術可以在15～20min內完成擴增，在實際應用中，以FMDV3D基因作為靶基因設計引物和探針，在此基礎上建立起實時熒光反轉錄重組酶聚合酶擴增（real-timeRT-RPA）檢測方法，以此對口蹄疫進行檢測，只需要在40℃恒溫條件下持續(xù)20min就可以完成檢測，且檢測結果與RT-qPCR檢測結果具有100%的符合率。除此以外，重組酶聚合酶擴增技術的應用對環(huán)境的適應性較強，因此在不同的實驗室中都能夠完成檢測工作，基于該方法的便捷性，可以采用便攜式等溫擴增儀-GenieⅢ實現(xiàn)快速檢測，操作簡單且快捷，對口蹄疫病毒株的血清型檢測也比較準確。

綜上所述，口蹄疫診斷技術在近幾年得到了迅速的發(fā)展，在檢測各種口蹄疫病毒株上發(fā)揮著重要的作用，從常見的血清學診斷、分子生物學診斷，到現(xiàn)階段的膠體金免疫層析快速診斷技術、逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術等新型的檢測技術，最終在我國口蹄疫診斷上形成了多方位且全面的診斷檢測手段，從而有效地提高了我國在口蹄疫診斷上的發(fā)展水平，為口蹄疫的防控工作提供了堅實的保障，為我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康、穩(wěn)定以及可持續(xù)發(fā)展奠定了堅實的基礎。