畜禽產品中四環素類抗生素殘留檢測方法研究進展

蘇 霞，王緒根，李 云，崔榮飛，馮騰壘，楊曉霞，趙金彩

（1.石家莊市畜產品和獸藥飼料質量檢測中心 050041；2. 行唐縣畜牧工作總站 050000；3. 行唐縣畜產品質量監測站 050000；4. 趙縣農業農村局 050000）

四環素類抗生素具有廣譜抗菌效應，對多種細菌具有較強的抗菌活性[1]，因此被廣泛應用于畜禽養殖中，以此來促進畜禽動物生長、改善畜禽飼料利用率、降低動物死亡率等[2]。然而，由于部分從業人員缺乏職業道德素養，只顧追求經濟利益，致使畜牧業中四環素類抗生素過度使用，導致食用畜禽產品中四環素類化合物的殘留限量嚴重超標，嚴重影響人們的身體健康[3]，因此國內外都對畜禽產品中四環素類抗生素殘留做了嚴格規定。為了遏制四環素類抗生素濫用現象, 2020年，我國農業農村部曾發布公告，禁止將包括土霉素、金霉素在內的藥物用作飼料添加劑；在《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中明確規定四環素、金霉素、多西環素和土霉素在畜產品中可以使用，但應制定最大殘留限量的藥物，牛/羊奶中的四環素類抗生素最大殘留限量為100μg/kg，雞蛋中四環素類化合物的最大殘留限量為400μg/kg[4]。目前，畜禽產品中常用的檢測四環素類抗生素殘留的方法有高效液相色譜法（HPLC）[5]、免疫層析分析方法、氣相色譜法（LC）、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）、高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS)等[6-10]。本文綜述了目前針對畜禽產品中殘留對四環素類化合物最新的檢測方法，希望為今后的四環素殘留檢測提供方法依據。

1 氣相色譜法-質譜聯用法（GC-MS）

氣相色譜-質譜聯用法（GC- MS）同時具有氣相色譜的高分辨率和質譜的高靈敏性的特點，可用于對難以區分的熱穩定性好且易揮發的化合物進行分離確證，其可根據化合物分子的特征離子碎片，準確鑒定化合物，因此被廣泛應用于畜禽產品中獸藥殘留檢測。 但是氣質聯用法的缺點是無法分析高沸點、揮發性差、熱穩定性差的化合物樣品，尤其對大多數生化樣品無法進行檢測，就需要采取液相色譜法或其他分析方法進行前處理分析。

倉公敖等[11]利用氣相色譜-質譜聯用法，建立了一種對雞肉、雞 肝、牛肉、河蟹、鰻魚及蜂蜜等畜禽產品中的土霉素、四環素的殘留檢測方法。該方法前處理過程中，將樣品用異丙醇和乙酸乙酯（40 ∶60）進行分離提取，然后再經弱陽離子交換柱分離后，經氣質聯用儀分析確證，該方法回收率達到60%以上，檢測限達到0.05～3.59 mg/kg之間，表明此方法具有較高的準確性和靈敏性。

2 液相色譜-質譜聯用法

液相色譜- 質譜聯用法（LC-MS）依靠液相色譜系統，將樣品中復雜的化學組分進行分離，然后通過質譜系統檢測特征分子離子峰，對樣品中的化合物進行分析測定。該方法將液相色譜與質譜的優點相結合，具有特異性高、靈敏度高的特點，因此被廣泛應用于藥品、食品、醫學等多種分析領域中。

劉柏林等[12]建立了一種同位素內標-超高效液相色譜-質譜聯用法測定禽類產品中喹諾酮與四環素殘留限量的檢測方法，在該方法前處理過程中，采用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液絡合金屬離子，并以鎢酸鈉與鹽酸體系為沉淀劑，使樣品基質中的蛋白質變性，從而除去基質中的蛋白質雜質，固相萃取柱凈化，并將樣品經液相色譜-質譜聯用儀分析測定。采用多反應監測模式監測，同位素內標法定量，結果表明喹諾酮與四環素類抗生素藥物殘留在0.1～50.0 μg/L的濃度范圍內線性良好，檢出限為0.05～0.20 μg/kg，回收率達到60.6%～117.9%。該方法在前處理過程中降低了樣品中待測物的損失，適用于批量測定畜禽產品中喹諾酮和四環素類抗生素。高志瑩等[13]建立了一種利用超高效液相色譜-質譜聯用法(UPLC-MS)同時測定牛奶中四環素類抗生素殘留檢測限量的方法，該方法將樣品用EDTA-2Na-Mcllvaine緩沖液提取分離，然后經PLS固相萃取柱凈化，最后用10%甲醇-乙酸乙酯洗脫，經液相色譜-質譜聯用儀分析測定。該方法實現了在4min內可完成四環素類化合物的完全分離，方法靈敏度高，特異性好，方法回率達到81.5%～115.1%之間。張崇威等建立了利用液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋及牛奶中的四環素類化合物的檢測方法，該方法樣品基質用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取，然后用裝有脫脂棉的HLB固相萃取柱富集凈化后，經液相色譜-質譜聯用儀檢測。該方法中四環素類抗生素在5～100 μg/kg范圍內線性關系良好，方法檢測限達到2μg/kg，定量限則為5μg/kg，方法回收率達到81.2%～110.0%之間。該方法所得的各項指標均符合殘留檢測標準要求，適用于雞蛋及牛奶中四環素類抗生素殘留限量測定。陳艷等[14]利用超高效液相色譜-串聯質譜法對鹵肉制品中的四環素進行殘留檢測，該方法中，四環素類抗生素在濃度0.1～10 μg/mL之間線性范圍良好，線性相關系數在0.99以上。在3個不同濃度的加標回收下，該類化合物的平均回收率達到76.7%～103.7%，相對平均偏差則為3.2%～4.6%。抽取樂山地區部分市售食用畜產品，利用此方法測定里面的四環素類藥物殘留限量，結果表明該類化合物的殘留含量均符合標準，表明該方法具有選擇性好、靈敏度強的優點，可用于市售食用畜產品中四環素類藥物含量測定。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是將液體作為流動相，并結合高壓輸液泵，將具有不同極性的流動相泵入到色譜柱中，在色譜柱內利用各組分的極性不同，進行分離，最后進入檢測器進行檢測，從而實現對樣品的分析。按其分離機制的可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子對色譜法等，該方法靈敏度高、特異性強，因此被廣泛應用于畜禽產品中各種獸藥殘留檢測分析。

劉文靜等[15]利用固相萃取-高效液相色譜法，實現了對乳品飲料中四環素類抗生素的殘留檢測。該方法中，前處理過程用乙腈沉淀樣品蛋白，然后采用HLB固相萃取柱分離凈化樣品，以乙腈：甲醇：0.01mol/L草酸溶液（18∶5∶77）作為流動相，經高效液相色譜檢測分析。該方法中，四環素類藥物在0.10～1.00μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.994，檢出限為2.0～5.0μg/kg，回收率在77.6 %～90.6 %，表明該方法選擇性強、靈敏度高，適用于乳品中四環素類抗生素藥物殘留檢測。李桂琴[16]等分別以HLB固相萃取柱、氨基柱和C18柱用于樣品前處理過程中樣品的分離富集，結果發現氨基柱對乳品的富集凈化效果最理想，因此以氨基柱作為前處理凈化柱，然后以0.1%甲酸-甲醇作為洗脫劑洗脫樣品，以水乙腈（1∶4）為流動相，建立了利用超高效液相色譜法測定牛奶及奶制品中四環素類抗生素藥物殘留，結果表明該方法線性關系良好，準確度高。高旭東等[17]利用高效液相色譜法，實現了測定畜禽肉和三文魚中的四環素類化合物的殘留檢測分析，該方法以Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（pH=4.0）作為提取液，然后用三氯乙酸沉淀樣品，經固相萃取柱富集凈化待測樣品，以0.01 mol/L草酸溶液∶乙腈∶甲醇（73∶17∶10）作為流動相。結果表明該類加標回收率達到74%～90%，相對標準偏差在3%～8%之間。表明該方法準確度高、靈敏度強，適用于檢測畜禽產品中土霉素、四環素和金霉素藥物殘留。

4 免疫層析法

免疫分析法主要包括放射免疫測定法、酶聯免疫吸附測定法（ELISA）、金標檢測試紙法等。免疫分析法操作簡便、靈敏性高、適用于批量檢測樣品，被廣泛應用于畜禽產品中四環素類抗生素殘留檢測。張正英等[18]用熒光免疫層析法，完成了對青海牦牛肉中四環素藥物殘留分析，該方法的定量限達到10μg/kg，樣品回收率達到80.0%～120.0%，表明該方法準確度高、靈敏性強。此外，該方法中30 min內可完成樣本的前處理工作，10min完成樣品的定量檢測。陳燕妮[19]等利用酶聯免疫吸附測定法，建立了一種對牛奶和蜂蜜樣品中四環素類抗生素殘留檢測方法。該方法中，該類化合物的加標回收率達到89.9%～105.1%之間，表明該方法準確度高、操作簡便快速，適用于牛奶樣品四環素類抗生物的藥物殘留檢測。

5 小結

近年來，隨著經濟的不斷發展，人們對食用畜產品的質量問題也越來越重視，因此需要開發高效、靈敏的畜禽產品中抗生素殘留檢測技術。本論文綜述了針對檢測畜禽產品中殘留四環素類抗生素的研究進展，其中高效液相色譜法與液質聯用法應用廣泛，該方法高效、靈敏、穩定可靠，但具有前處理復雜、操作難等缺點，因此檢測四環素類化合物的方法還需進一步研發，以保障人民的食品安全。