基于網絡藥理學與分子對接探討降糖舒心方治療2型糖尿病合并冠心病的機制*

王 桐，徐梓輝

(陸軍軍醫大學第二附屬醫院中醫/中西醫結合科，重慶 400037)

2型糖尿病(T2DM)是由胰島素抵抗伴隨胰島β細胞功能缺陷所導致胰島素分泌減少(或相對減少)引起的以高血糖為主要特征的代謝紊亂疾病[1]，其患病人數約占總糖尿病患病人數的90%。冠心病是心臟冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變引起血管腔狹窄或阻塞造成心肌缺血、缺氧、壞死而導致的心臟病[2]。有研究發現，T2DM患者發生微血管并發癥(包括視網膜病變、腎病和神經病變)和大血管并發癥(如心血管并發癥)的風險很高[3]，同時，冠心病等大血管并發癥是造成糖尿病患者死亡的主要原因[4]。因此，及早發現和治療能有效緩解T2DM合并冠心病患者癥狀，延長患者壽命。目前，西藥降糖作用較肯定，但其存在不良反應及停藥后反彈，整體療效并不令人滿意[5]。隨著中醫藥事業的發展，中醫藥在防治T2DM合并冠心病的臨床實踐中體現出一定的優勢和綜合療效，能有效改善患者臨床癥狀和預后。

降糖舒心方是由湖南中醫藥大學博士生導師陳大舜教授根據糖尿病合并冠心病的病機分析結合自己臨床體會在左歸丸基礎上化生的用于治療T2DM合并冠心病的專病方，由熟地、黃芪、山茱萸肉、枸杞、菟絲子、丹參、川芎、蒲黃、膽南星、黃連、藿香組成。經多例臨床驗證對改善空腹及餐后血糖、糖化血紅蛋白、胰島素敏感指數、血脂成分、心電圖等均具有療效[5]。但其作用機制尚有待于進一步研究。網絡藥理學是基于系統生物學的理論對生物系統的網絡分析,從整體觀角度認識藥物與機體相互作用并指導新藥的發現，特別適用于中藥與慢性疾病的研究[6-8]。本研究通過網絡藥理學方法探討降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的靶點及作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

使用TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索降糖舒心方中熟地、黃芪、山茱萸、枸杞等 11 味中藥的所有化學成分，同時根據藥物代謝動力學相關參數將藥物口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選的條件，將預測得到降糖舒心方的潛在作用靶點導入Uniprot 數據庫(https://www.uniprot.org/),將所檢索到的靶點校正為規范名稱。

1.2 方法

1.2.1靶點獲取

以coronary heart disease、type 2 diabetes作為關鍵詞,分別在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)與DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)中檢索冠心病和T2DM相關靶點，合并兩個數據庫結果并去除重復值。

1.2.2蛋白質相互作用網絡(PPI)構建及核心網絡篩選

使用在線Venny軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對篩選出的降糖舒心方活性成分的靶點與疾病靶點取交集并繪制韋恩圖，得到降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的潛在共同作用靶點，然后再將共同靶點帶入在線網站STRING 11(https://string-db.org)獲取蛋白相互作用的關系，下載制表符分隔值(TSV)文件，然后使用Cytoscape3.8.2軟件繪制網絡圖，cytoHubba插件尋找PPI中的關鍵基因。

1.2.3共同靶點通路分析

將篩選得到的降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的靶點使用clusProfiler R包進行基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析與可視化處理。將58個共同靶點基因導入R軟件并引用Colorspace、Stringi、Ggplot2、Bioconductor庫中的DOSE、ClusterProfiler、Enrichplot語言包進行富集分析，設定P<0.05。

1.2.4構建藥物-活性成分-靶點-通路網絡

使用Cytoscape3.8.2軟件分別構建藥物-成分-靶點、有效成分-共同靶點、共同靶點-GO分析-KEGG通路分析網絡，并分析活性成分及靶點的網絡拓撲參數，根據網絡拓撲學參數判斷發揮藥效的主要活性成分。

1.2.5分子對接驗證

1.2.5.1小分子化合物的準備

對接的化合物[包括槲皮素(Quercetin)、花生四烯酸(Arachidonic-acid)、β-谷甾醇(beta-Sitosterol)、異鼠李素(Isorhamneti)、山奈酚(Kaempferol)]來自PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，將所有的結構導入Schrodinger軟件建立數據庫，通過加氫、結構優化和能量最小化,保存后作為分子對接的配體分子數據庫。

1.2.5.2靶點蛋白結構的準備

靶點蛋白晶體結構從蛋白質數據庫下載(https://www.rcsb.org/structure/)，蛋白結構在Maestro11.9平臺進行處理，用Schrodinger的Protein Preparation Wizard處理蛋白，去除結晶水，補加缺失的氫原子，并修復缺失鍵信息，修補缺失肽段，然后對蛋白進行能量最小化、以及幾何結構的優化[9-10]。

1.2.5.3分子對接

對虛擬篩選的處理和優化是通過Schrodinger Maestro軟件中的Glide模塊完成的。對蛋白質的處理利用Protein Preparation Wizard模塊。對受體進行預處理、優化和最小化(利用OPLS3e力場進行約束最小化)。所有化合物均按LigPre模塊的默認設置制備。在Glide模塊中進行篩選時導入制備好的受體，以在受體網格生成中指定合適的位置。選取蛋白的原配體作為10?盒子的質心。首先將原配體進行再對接，確認對接方法選擇的可行性。然后對接結果通過 Pymol(2D)和 LigPlus(3D)可視化。將Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol、Arachidonic-acid、beta-Sitosterol與TOP10靶點蛋白進行分子對接。通常計算結合能以評估成分與蛋白質靶標的親和力程度。一般認為，結合能小于-4.25、-5.0或-7.0 kcal/mol分別表示配體與受體之間具有一定、良好或強的結合活性。結合能反映了受體與配體結合的可能性。結合能越低受體與配體的親和力越高，構象越穩定[11]。

2 結 果

2.1 活性成分及靶點

以 OB≥30%、DL≥0.18為篩選標準，在TCMSP數據庫中檢索降糖舒心方的主要化學成分，并進一步篩選。包括川芎4個，丹參14個，枸杞8個，廣藿香5個，黃連8個，蒲黃6個，天南星4個，菟絲子8個，黃芪8個，山茱萸9個，熟地黃2個，去除重復值，共發現降糖舒心方中含有主要化合物54個。見表1。同時通過TCMSP數據庫共檢索出化合物相關靶點141個，采用Cytoscape3.8.2軟件構建降糖舒心方“藥物-成分-靶點”網絡圖。見圖1。

圖1 藥物-成分-靶點圖

表1 降糖舒心方活性成分

2.2 降糖舒心方與疾病共同靶點

通過對GeneCards和DisGeNET數據庫的檢索，得到T2DM相關靶點2 755個、冠心病相關靶點1 246個，將141個降糖舒心方的作用靶點與T2DM相關靶點和冠心病相關靶點繪制韋恩圖，三者取交集后獲得共同靶點58個。見圖2。有效成分與取交集選取出來的58個共同靶點的網絡圖見圖3。

圖2 降糖舒心方靶點T2DM、冠心病的共同靶點韋恩圖

2.3 PPI構建

在STRING數據庫導入58個共同靶點基因構建PPI圖，其中57個靶點基因關系緊密，糜蛋白酶原B1與其他靶點基因無相互作用(未顯示)，使用cytoHubba插件中最大集團中心性方法得到的前十關鍵基因為白細胞介素-6(IL-6)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)、V-REL網狀內皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、FBJ小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物(FOS)、過氧化物酶體增值物激活受體γ(PPARG)、缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、核受體亞家族3C組成員1(NR3C1)、雌激素受體α(ESR1)等，表明這些基因在PPI中具有關鍵橋接作用，可能是降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的核心靶點，靶點之間相互作用關系見圖4。顏色越紅表示在網絡中越重要，其他方法得到的TOP10基因見表2。

表2 通過使用cytoHubba插件下的不同方法獲得的Top 10基因

圖4 PPI圖

2.4 GO功能分析

共獲得1 526個條目，根據P值由小至大排序選取前10個GO條目，可視化分析結果見圖5。

圖5 GO生物過程分析

2.5 KEGG通路分析及構建共同靶點-GO分析-KEGG通路網絡

主要確定了84條主要信號通路，根據P值由小至大排序選取前20個條目，可視化分析結果見圖6。共同靶點主要富集在脂質與動脈粥樣硬化、流體剪應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物(AGE)-AGE 受體(RAGE)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路等，涉及代謝、凋亡等多方面，提示降糖舒心方治療T2DM合并冠心病可能與影響這些信號通路有關。然后在84條KEGG信號通路中篩選與T2DM和冠心病相關且P值排名靠前通路，利用Cytoscape3.8.2軟件構建共同靶點-GO分析-KEGG通路網絡。見圖7。

圖6 KEGG通路富集分析

圖7 共同靶點-GO分析-KEGG通路網絡

2.6 分子對接

Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol、Arachidonic-acid、Beta-sitosterol可以很好地與TOP10蛋白質靶點的活性位點結合。其中NOS3與Quercetin對接結合能最低(-9.10 kcal/mol)。見圖8。降糖舒心方的3種代表性化合物(Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol)可以與T2DM合并冠心病的3個核心靶點(IL-6、VEGFA、NOS3)很好地結合，形成穩定的復合體。見圖9、10。以上這些可能在T2DM合并冠心病的治療中發揮關鍵作用。

圖8 主要活性成分與TOP10基因分子對接結合能熱圖

圖9 Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol分子結構式

A：IL-6與Quercetin；B：IL-6與Isorhamnetin；C：IL-6與Kaempferol；D：VEGFA與Quercetin；E：VEGFA與Isorhamnetin；F：VEGFA與Kaempferol；G：NOS3與Quercetin；H：NOS3與Isorhamnetin；I：NOS3與Kaempferol。

3 討 論

中醫本無糖尿病、冠心病之名，根據其臨床癥狀、體征分別歸屬于消渴、胸痹等范疇，均多發于中、老年人。目前，兒童及青少年發病率也在不斷上升。其發病、病機可概括為飲食不節、情志失調、勞欲過度等因素導致的陰虛內熱、消灼津液，病程日久，陰損及陽，氣陰兩虛，瘀血阻滯，痰濕內生，變生百癥。瘀血、痰濕作為糖尿病合并冠心病發生、發展過程中的病理產物，阻于心脈而發為胸痹。

降糖舒心方是經過多年臨床觀察和研究所得的復方中藥制劑，對調節糖脂代謝、改善代謝綜合征患者臨床癥狀具有肯定療效。其主要由熟地、黃芪、山萸、枸杞、菟絲子、丹參、川芎、蒲黃、膽南星、黃連、藿香等組成。以熟地、黃芪為君補益腎之氣陰，以冀腎氣復則司溫煦心火之能，腎陰充則上滋心陰而司濡養心營之功，二者相伍，陰陽互濟，使心之氣營平秘，心絡得以煦濡則自無心痛之慮。臣以菟絲子、山萸肉、枸杞補益肝腎，菟絲子補陽益陰，山萸肉溫澀，與枸杞甘平養陰相伍，并助熟地以陰中求陽，陽中求陰，共濟腎臟水火之功，且能兼以治肝，使肝氣通則心氣和(《明醫雜著·醫論》)；丹參、川芎、蒲黃行氣、活血、化瘀通絡，使心絡通暢，通則不痛，心痛常能蠲除。膽南星、黃連為佐藥，苦寒、清熱、化痰，以祛久蘊心絡之痰熱脂濁，使絡脈通而心痛止。藿香為使藥，芳香行散，化濕濁而祛心痛(《別錄》)。全方陰陽互濟，寒溫并調，補通兼施，補而不礙邪，攻而不傷正，共奏益氣養陰、活血祛瘀、化痰通脈之功，適用于消渴并胸痹、氣陰兩虛、瘀痰阻絡之證，以期達到陰陽平、瘀血祛、痰濕除、心脈通而疼痛止之功效。

本研究應用網絡藥理學技術經篩選發現中藥復方降糖舒心方中有效成分54個，作用靶點141個，其中與T2DM合并冠心病共有靶點58個。同時構建了藥物-有效成分-靶點網絡、有效成分-共同靶點網絡和共同靶點-通路網絡，分析了有效成分、靶點、通路之間的作用關系，結果顯示，Quercetin、Kaempferol、Isorhamnetin、Arachidonic-acid、beta-Sitosterol匹配靶點較多，可能為降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的核心組分。Quercetin是一種黃酮類化合物，具有增強胰島素敏感性、促進胰島素分泌、促進糖原合成、抑制α-葡萄糖苷酶活性等抗糖尿病作用[12],并且可通過抑制炎癥、保護內皮功能等多條通路起到心血管保護作用[13]。Kaempferol是黃酮類化合物，其對預防與治療糖尿病、心血管疾病具有積極作用[14],具體表現在抗炎、抗氧化、抗凋亡等方面，如可通過AGE-RAGE/MAPK通路減少氧化應激和炎癥，從而緩解糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注損傷[15]。Isorhamnetin是黃酮類化合物，可通過調節核因子κB(NF-κB)、磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、MAPK等信號通路及其下游因子起到心腦血管保護、抗炎、抗氧化、降血糖等作用[16]。Arachidonic-acid是一種重要的人體必須脂肪酸，對維持人體細胞與功能具有重要作用，由于Arachidonic-acid在人體代謝中處于核心地位，所以，Arachidonic-acid及其衍生物可將營養代謝與免疫和炎癥聯系起來，從而在糖尿病、肥胖、心血管疾病的出現和進展中具有關鍵作用，目前認為，Arachidonic-acid對預防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要功效[17]。beta-Sitosterol是甾醇類化合物，具有抗焦慮、抗炎、抗氧化、抗糖尿病等功效，同時可降低血液中膽固醇水平，降低發生心臟病的風險[18]。此外，Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol抗T2DM與冠心病的靶基因或通路與本研究中確定的降糖舒心方抗T2DM與冠心病的靶基因和通路部分一致，表明降糖舒心方通過多組分、多靶點的相互作用治療T2DM合并冠心病。

為探索降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的核心靶點，本研究構建了58個共同靶點的PPI，得到顯著性較大的靶點，包括IL-6、VEGFA、MAPK8、NOS3、ESR1、EGFR等，尤其是IL-6、VEGFA和NOS3，可能是降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的核心靶點。IL-6在PPI中節點數量最多，可能是降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的最重要的靶點。IL-6在多種疾病中均具有明顯改變，其表達失調也可引起多種疾病的發生，慢性暴露于IL-6可導致低級組織特異性或全身性炎癥，干擾胰島素信號通路，促進β細胞凋亡，并且通過多種炎癥信號途徑促進多器官的胰島素抵抗[19]。IL-6能損害內皮功能并作用于血管壁的斑塊，加速斑塊的破裂[20]。除IL-6外，VEGFA在生理及病理條件下調節血管生成與血管滲透性，在糖尿病及其并發癥發病過程中具有關鍵作用[21]。在心血管方面VEGFA可通過ROS-ER stress-autophagy軸促進急性心肌缺血后的血管再生[22]。VEGFA可通過與VEGFR-1、VEGFR-2結合調節血管生成、血管通透性和炎癥，影響動脈粥樣硬化的發生與發展[23]。過去的研究發現，NOS3在內皮細胞的正常功能中發揮著重要作用，其相關途徑的損害與包括糖尿病在內的各種血管病變密切相關[24]。剪切應力通過PI3K/Akt途徑調控NOS3表達，進而影響內皮細胞增殖、血管舒張、血管收縮和炎性反應[25]。進一步支持了本研究關于IL-6、VEGFA、NOS3等靶點基因在降糖舒心方治療T2DM合并冠心病中具有重要意義的發現。

本研究降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的靶點GO通路富集顯示，生物過程主要包括細胞對化學應激的反應、氧化應激反應、對細胞外刺激的反應等，細胞組分主要包括脂筏、膜微區、囊腔等，分子功能主要包括轉錄因子結合、類固醇結合、核受體活性等。KEGG信號通路富集分析顯示，降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的主要通路有流體切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、PI3K-Akt信號通路等，突出了降糖舒心方通過多種途徑治療T2DM合并冠心病。

心臟冠狀動脈的粥樣硬化是冠心病發病原因，動脈粥樣硬化是一種慢性炎性病變，內皮細胞功能障礙是起始環節，而力學刺激是影響心血管系統的一個重要因素。已有學者指出，剪切應力可誘導血管炎癥、內皮間質轉化和自噬等信號通路，與動脈斑塊的形成與破裂具有很重要的聯系，在動脈粥樣硬化病變的發生和發展中具有關鍵作用[26-28]。AGE是一組在蛋白質、脂肪酸或核酸的氨基基團與還原糖的醛基之間發生非酶性糖基化反應所形成的一系列具有高度活性終產物的總稱。AGE與RAGE結合后可激活細胞Janus激酶2-信號轉導子與轉錄激活子-干擾物激活反應元件(JAK2-STAT-ISRE)、PI3K-Akt、ROS、MAPK-ERK、NF-κB通路，調控細胞分化、凋亡、促進氧化應激、炎性反應等，同AGE-RAGE軸的激活可通過二肽基肽酶4分泌系統(DPP4-incretin system)、整合素連接激酶-哺乳動物雷帕霉素蛋白通路(ILK-mTOR)、代謝記憶(Metabolic memory)相關通路促進糖尿病性動脈粥樣硬化的形成[29]。TNF是組成急性炎性反應的細胞因子之一，可觸發MAPK、NF-κB途徑，導致胰島素抵抗的發生,TNF還參與各種心血管疾病的發展,包括病毒性心肌炎、急性心肌梗死、動脈粥樣硬化和慢性心力衰竭[30]。PI3K-Akt信號通路參與了許多細胞進程的調控，包括細胞生長、細胞增殖及糖脂代謝、胰島素作用等，PI3K-Akt及其下游分子也被認為是肥胖、糖尿病及其并發癥、冠心病的治療靶點[31-34]。有研究證實，Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol等化合物正是通過以上信號通路影響了T2DM與冠心病的進展。如Quercetin作為一種常見的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制AGE在血管內蓄積等生物學功能，其機制與PI3K-Akt通路、AGE-RAGE通路、NF-κB通路密不可分[35]。Kaempferol是最常見的膳食類黃酮之一，具有抗氧化、抗凋亡、抗糖尿病、抗腫瘤等生物學活性，可通過AGE/RAGE/MAPK通路減輕糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注損傷[15]。Kaempferol的攝入可降低冠心病發病率和病死率[36]。Kaempferol通過抑制p38/c-Jun氨基末端激酶(JNK)/TNF-α/NF-κBp65通路防止大鼠心臟缺血再灌注損傷并改善心功能[37]。

基于以上網絡藥理學分析結果，本研究又對降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的主要活性化合物與TOP10基因靶點蛋白進行了分子對接實驗，結果顯示，這些活性成分與靶點蛋白大多具有較低的結合能，可形成穩定的復合物。同時展示了3個關鍵活性成分(Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol)和3個具有代表性的靶點(IL-6、VEGFA、NOS3)的分子對接示意圖，顯示出Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol與核心靶點IL-6、VEGFA、NOS3具有較高的親和力，且結合位點均有穩定的氫鍵，構象穩定。表明活性成分可直接影響機體炎癥水平，改善血管內皮細胞增殖狀態，進一步驗證了降糖舒心方可能通過以上多種活性成分作用于多靶點而影響T2DM與冠心病的發展。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法對降糖舒心方的有效化學成分、作用靶點和其對T2DM合并冠心病的作用途徑進行了探索性研究，證實了降糖舒心方治療T2DM合并冠心病是通過多成分、多靶點、多途徑的協同作用發揮療效的，為后期研究提供了理論依據。