EMT在結腸癌干細胞“干性”獲得與維持中的作用及機制研究進展

康毅，周晏因 綜述 朱蓉 審校

遵義醫科大學附屬醫院消化內科，貴州 遵義 563000

結腸癌是全世界第三大常見的癌癥，由于近年來早期診斷與治療手段的進步，雖然結腸癌死亡率逐漸降低，但其五年生存率也僅為65%[1]。結腸癌轉移不可缺少的條件包括結腸癌干細胞(colon cancer stem cells，CCSCs)的維持、上皮間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)、結腸癌細胞的血管生成等。其中上皮間充質轉化不僅可使腫瘤細胞發生浸潤、轉移和耐藥，還給予結腸癌干細胞一定特性、促進結腸癌干細胞的出現，CCSCs也可通過相關通路完成向EMT的轉化。進一步探討CCSCs與EMT的相互關系及其調控機制，有助于理解CCSCs 可塑性，進而促進二者的理論融合以及為結腸癌的診斷、治療提供新的方向。

1 CCSCs

腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)是指具有自我更新能力并且可以通過自我更新和無限增殖維持腫瘤細胞群的生命力的細胞[2]；CSCs 理論認為CSCs是腫瘤的種子和源泉，是腫瘤存活、增殖、轉移及復發的“起點細胞”或“動力細胞”，在整個腫瘤的產生與生長過程中起著不可替代的作用。CCSCs 是結腸惡性腫瘤中一小部分擁有自我更新與無限增殖能力，而且可以形成異質性結腸癌細胞的細胞亞群，并受基因組、表觀遺傳因素和腫瘤微環境等影響[3]，雖然其在腫瘤總體細胞中的占比很小(0.1%～0.25%)，卻與結腸癌的產生、增殖、轉移和不良預后有著相當密切的聯系。早期結腸癌組織內干細胞特性的激活能夠促進癌細胞的增殖、侵襲[4]，在SCHWITALLA等[5]的研究中證實，核因子(NF)-κB能夠通過活化的Wnt 信號通路，在炎性腫瘤微環境中可以誘導非干細胞去分化，使組織獲得致瘤性，并且腸上皮細胞NF-κB 的功能亞基RelA/p65 的敲除可以阻止腸腺窩干細胞的擴增，這表明炎癥信號對CCSCs 的產生及去分化產生重要影響。此外，來自YANG 等[6]研究表明，在正常和輻射環境下，CCSCs和非CCSCs之間具有一定的轉換和動態平衡能力，在此過程中，TGF-β 或許通過激活EMT從而在平衡中起重要作用。

2 EMT

在人體的組織中有各種細胞，而間充質細胞和上皮質細胞是不可或缺的兩種，它們在細胞表型和細胞功能上具有明顯差異。上皮細胞顯示出顯著的極性，它們面向體表或有腔器官的腔面的一面稱為游離面，面向深層結締組織的一面稱為基底面，兩者在結構和功能上存在明顯的不同，上皮細胞在結構上有清晰的邊界，分層排列，細胞間存在著中間連接、閉鎖連接、通訊連接和橋粒等，從而細胞彼此之間連接十分緊密，使得單個上皮細胞缺乏活動性，它的移動由整層細胞形狀變化所引起。然而，間質細胞沒有顯著的極性，細胞間的黏附作用相比上皮細胞較弱，缺乏局部特異性和可塑性，它可以通過在細胞外基質的游走，據此實現單個細胞的移動[7]。EMT是指通過一定程序將上皮細胞轉化為具有間質表型細胞的生物學過程[8]，具體而言，是指除去部分上皮細胞已分化的表型，從而獲得了部分間充質細胞的表型[9]。因而EMT 及其逆轉過程MET在胚胎發育、慢性炎癥、腫瘤的發生發展和浸潤轉移等過程扮演著十分重要的角色[10]。EMT的發生受轉化生長因子-β (TGF-β)、Wnt/β-catein、Notch、核轉錄因子-κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)等信號通路調控，其中關鍵環節是這些轉錄因子或信號通路抑制上皮組織中的細胞黏附分子鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(ZO-1)、細胞角蛋白(CK)等的表達，誘導間充質細胞表型標志物N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、成纖維細胞特異性蛋白1(FSP1)和骨橋蛋白(Osteopontin)等表達，導致細胞間的黏附力減弱，并且結腸癌細胞的侵襲能力提高。

3 EMT是CCSCs形成的關鍵

2007 年，O'BRIEN等[11]分離出CD133+結腸癌干細胞，其后發現的主要結腸癌干細胞標志物包括CD133、Lgr5、CD44、CD166、EpCAM、ALDH1、CD24、CD26、ITGB1、Oct4、Sox2、Nanog 等，這些CCSCs標志物的發現，不僅利于結腸癌的診療，而且還有助于探索新的結腸癌靶向治療方法。發生EMT時，上皮細胞在某些特定的情況下向間充質細胞轉化，此轉化過程會導致上皮細胞的極性的喪失，此時細胞間的緊密連接和中間連接等重要連接丟失，與周圍細胞和基質的接觸減少，而細胞遷移、侵襲、增殖等能力得以增強[12]。腫瘤細胞發生EMT 伴隨著上皮表型分子(E-cadherin、α-catenin、β-catenin、細胞角蛋白、黏蛋白、橋粒蛋白)的下調和間充質表型分子(Vimentin、纖連蛋白、神經型鈣黏蛋白、基質金屬蛋白酶 MMP-2、MMP-3、MMP-9)的上調，它增強了細胞遷移和侵襲的能力，并且在腫瘤復發和耐藥性中也扮演者重要的角色。新近研究表明，EMT和CCSCs之間或許存在著密切的關系，EMT可以刺激腫瘤干性的產生。

EMT 誘導的CCSCs 和致瘤性的機制，包括相關基因和各種通路被證實參與其中。研究發現，發生EMT 的腫瘤細胞具有干細胞樣的特征[13]，目前參與CCSCs 生長的信號通路主要有 Wnt、Notch 和 mTOR等信號通路。轉谷氨酰胺酶2(TGM2)在CCSCs中的有一定作用，TGM2 在致瘤細胞中的表達水平比非致瘤細胞高25 倍，通過特異性RNA 干擾敲除TGM2 可以顯著抑制細胞生長并引起干性標記CD133、SOX2和β-catenin 的下調，敲低TGM2 可以通過下調N-cadherin和Vimentin以及上調E-cadherin來抑制細胞轉移能力。人結腸直腸癌中TGM2表達顯著增加，而下調TGM2 可作為結直腸癌患者的治療方法。這表明TGM2 通過調節EMT 和干性相關蛋白影響CCSCs 的轉移潛力和干性，CSCs 的轉移潛力來自高表達的TGM2[14]。R-spondin(RSPO)家族是近年來新發現的由4種分泌型蛋白組成的蛋白家族，其中RSPO2 是經典Wnt/β-catenin 途徑的激動劑，是腸道干細胞(ISCs)的生長因子，被認為在CCSCs中起著重要的作用。但是，尚不清楚RSPO2在CCSCs 中的具體功能，有研究表明，RSPO2可通過增強EMT 促進HCT116 球狀細胞的侵襲，RSPO2是CCSCs 的潛在生長因子，通過無血清DMEM/F12 培養基(SFM)培養有助于豐富CCSCs，并且在結腸癌的轉移中起著至關重要的作用[15]。此外，有研究表明，PRDX2可以抑制TGF-β1誘導的結直腸癌細胞的EMT進程，并可促進MET發生，使結直腸腫瘤細胞侵襲和轉移得到抑制[16]。

腫瘤的轉移和復發一直是腫瘤治療所面臨的一項嚴峻挑戰，有證據顯示，CSCs 和EMT 是腫瘤形成、轉移、復發的關鍵因素。研究發現，當Bmi-1 被小干擾 RNA(siRNA)沉默時，CD133+/CD44+HCT116 細胞的侵襲和遷移能力顯著降低，RT-qPCR 和蛋白質印跡分析的結果表明Bmi-1 對E-cadherin 的表達有負面影響，Bmi-1 或許經過誘導 EMT 下調 E-cadherin 促進CCSCs 的侵襲和轉移[17]，使得Bmi-1 有望成為結腸癌治療的新型治療靶標[18]。盡管較早的研究表明CCSCs與EMT 在腫瘤發展中有一定聯系，但關于CCSCs 與EMT之間的關系仍存在爭議。研究發現，球形細胞顯示出較低的同型/異型黏附力，但具有更高的體外遷移/侵襲能力，以及更高的體內致瘤和轉移潛能。球狀細胞還顯示出 E-cadherin 下調，α-SMA 和 Vimentin 表達上調，這也證明了EMT的發生。它表明球狀細胞具有CCSCs的特征，EMT則可能解釋了它們的干性和惡性，而Wnt/β-catenin途徑的持續激活可能在CCSCs的EMT中起重要作用[19]。

藥物作用及腫瘤微環境因素也是EMT向CCSCs發生發展的重要因素。非甾體類抗炎藥阿司匹林通過上調E-cadherin 表達，下調N-cadherin、Vimentin、Snail1表達從而抑制HT-29細胞EMT；非甾體抗炎藥可通過EMT減弱人結腸癌細胞的遷移和侵襲能力[20]。腫瘤微環境包括炎癥、酸性、低氧等，它們與結腸癌細胞的發生、生長等關系密切[21]。研究發現，在結直腸癌中，肝細胞生長因子(HGF)可以促進癌細胞的EMT，此過程還伴隨著腫瘤細胞中Wnt信號通路的激活[22]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以在化療中分泌多種生長因子，如IGF-1、VEGF 和 HGF 等；還有趨化因子SDF-1/CXCR4 以及炎癥細胞因子IL-6 和TNF-α等，這些生長因子通過STAT3、PI3K/AKT和Wnt等信號通路的作用，使得腫瘤細胞避免被化療藥物所損傷，并觸發腫瘤細胞的EMT 與干細胞特征[23]。

4 CCSCs對EMT的影響

微小RNA(miRNA)于1993年首次發現，是一大家族的小分子非編碼18-25 nt 單鏈寡核糖核苷酸，在轉錄后起作用，負調控信使RNA(mRNA)的翻譯。近期研究發現，轉錄因子Ascl2 通過轉錄調節miRNA-200家族，進而抑制結腸癌HT-29 和LS174T 細胞株的EMT，從而影響結腸癌的浸潤和轉移[24]。微小RNA是腫瘤發生EMT與轉移的調控因子，并且miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141與miR-429)和miR-205家族可以激活EMT過程，其作用機制與上皮細胞的E-cadherin 的表達降低有關[25]。MSCs 在體外可以抑制人結腸癌細胞SW480的轉移，這一作用可能與SW480 細胞的EMT 受到抑制有關，而其作用機制可能與Wnt/β-catentin信號通路有關。

在結腸癌中，化療和/或放療會導致耐藥細胞的形成，這些耐藥細胞會通過EMT轉移，EMT介導原發腫瘤中癌細胞的侵襲和轉移特性，使其失去細胞黏附能力，從而增加細胞間的分離，Polycomb 組蛋白(例如BMI1、SUZ12 和 EZH2)也存在失調，并且 microRNA-200 (miR-200)家族的表達也發生了變化。一項研究表明，DLD-1結腸癌細胞暴露于梯度濃度的奧沙利鉑(一種用于結腸癌的化學療法藥物)中產生一種化學抗性結腸癌細胞系(DLD-1-OxR)，測試其EMT 特性，發現其表現出EMT 特征，SUZ12 在DLD-1-OxR中上調，以SUZ12 為標靶的miRNA-200 家族成員被下調[26]。

癌的進展是一系列復雜的事件的結果，被認為包括了EMT的可逆發展過程，在體外，microRNA-200家族通過轉錄后抑制E-cadherin 阻遏物ZEB1 和ZEB2來維持上皮表型，EMT 參與轉移級聯反應，并表明miR-200 在基質浸潤的初始階段被下調，但在轉移部位得以恢復[27]。在EMT 期間，轉錄因子(如ZEB1、SIP1、Snail1 和 Slug)的增加會強烈抑制 E-cadherin 基因的轉錄，使上皮細胞間特有的強相互作用減弱。E-cadherin 抑制物可分為兩類[28-31]：一類為直接抑制物，如Snail1、Slug、ZEB1、ZEB2(SIP1)和E47，能夠直接抑制E-cadherin 的轉錄，另一類為間接抑制物，如Twist、Goosecoid、FOXC1 和 FOXC2 間接地下調 E-cadherin的轉錄。細胞因子轉化生長因子-β(TGF-β)是EMT的有效誘導物，miR-200 家族的過表達阻止了TGF-β誘導的EMT，暗示miR-200 家族是EMT 的調控者。也有資料顯示，miR-200 家族可以通過抑制ZEB1 和SIP1的翻譯來調控EMT[32]。研究表明，對結腸癌干細胞實行基因芯片分析曾發現：CCSCs除了可以高表達CD44 和CD166 以及其他干細胞標記分子外，調控EMT 的Snail 也可以同步高表達[33]。綜合以上研究證據，可以證明CCSCs和EMT之間存在密切聯系。

5 EMT和CCSCs的共同影響因素

結腸癌上皮細胞的EMT 是雙向、不完全的過程，EMT 與CCSCs 會受多種因素的調節。當腫瘤細胞發生 EMT 時，許多 EMT 相關轉錄因子(ZEB1、ZEB2、SNAIL、TWIST)的蛋白活性或基因表達快速地變化，從而調控其下游相關基因簇的表達，達到影響患者的預后的目的[34]。EMT在增強細胞侵襲能力的同時，其相關的轉錄因子如鋅指蛋白轉錄因子SNAIL 可促使結腸癌細胞獲得CSCs 的特性，從而獲得放化療抵抗能力[35-36]，SNAIL 是 EMT 的激活劑，在結腸癌分離出的結腸球中以高水平表達，SNAIL在結腸癌細胞中的過表達誘導了結腸球的大多數特性，包括細胞去分化。SNAIL 調節IL-8 和其他基因的表達以誘導CCSCs的活動[33]。TWIST是一種具有堿性螺旋-環-螺旋結構域的轉錄因子，TWIST 包括TWIST1 和TWIST2兩種亞型，有研究發現，TWIST1 是一種癌基因，也是EMT 的主要基因[37]。TWIST 也可通過上調胚胎基因的表達，從而介導胚胎的發育[38]，新近研究證實，TWIST可使腫瘤細胞一部分基因簇再編程，從而調控腫瘤細胞的EMT活動[39]。也有研究發現，TWIST在結腸癌組織中比癌旁組織的表達高，可驅動CSCs 相關基因表達，從而促使腫瘤細胞獲得干性[40]。TWIST1可使結腸癌HCT116 細胞發生EMT表型轉化，降低上皮細胞標志物E-cadherin 表達，并提高間充質細胞標志物 Vimentin 和 N-cadherin 表達，誘發 EMT 過程并促進腫瘤的轉移[41]，從而獲得干細胞特性，并進一步通過ABCB1/P-gp途徑增強結腸癌自身耐藥性[42]。

6 展望

CCSCs 是結腸癌產生、轉移、復發及產生耐藥性的根源，是結腸癌治療失敗的重要因素，EMT 也是結腸癌侵襲的關鍵環節。EMT 不僅增強結腸癌細胞轉移和侵襲能力，而且反饋性促進CCSCs 形成，CCSCs也參與了EMT 的維持及啟動，它們并不是絕對的因果關系，而是相互調控，并且受多種藥物和環境因素等的影響。尋找具有高度特異性的治療標靶是防治結腸癌的重要方式，探索EMT 和CCSCs 之間的轉化關系、深入研究該調控網絡中的關鍵靶點，有望為結腸癌轉移與復發的靶向治療開辟新思路，也必將成為核心發展方向。EMT 對CCSCs 的調控及分子機制目前不甚明了，在后續探索中，需進一步研究EMT 與CCSCs的雙向調控機制、處于不同分化階段的CCSCs與EMT的關系以及EMT和CCSCs靶向治療的安全性等，如若阻斷EMT 或可能將CCSCs 轉化為其終末細胞抑制增殖，將CCSCs轉化為具有較高分化程度的結腸癌細胞，為結腸癌的治療發掘更有效的手段。