北京黑豬FUBP3和USP43基因多態性與眼肌面積性狀的關聯分析

侯任達，張 潤，牛乃琪，楊 曼，黃曉宇，李慧慧，張龍超*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193； 2.山西農業大學動物科學學院，晉中 030801)

在過去幾十年里瘦肉型豬在豬肉消費市場中占有很大的份額，胴體瘦肉率在評價胴體品質方面是一個非常重要的指標，在胴體品質相關的性狀中應用廣泛[1-2]。然而育種場很難用大樣本來測定瘦肉率且豬胴體瘦肉率測定過程復雜，耗時長，成本高。因此，在實際的豬性能測定中一般采用其他相關性強的性狀來代替。何志平等[3]通過對杜×長二元雜交仔豬進行分析，發現瘦肉率與眼肌面積的相關系數為0.70，即瘦肉率與眼肌面積之間呈強相關。且通過眼肌面積來估測瘦肉率也可極顯著的降低成本[4]，所以在瘦肉豬的生產及選育工作中眼肌面積也是非常重要的指標[5]。影響眼肌面積的主要因素包括營養(如飼料的蛋白質含量)、環境、遺傳等[6-9]。而遺傳被廣泛認為是眼肌面積發育的最重要因素，遺傳度在0.35～0.47之間[10-12]，表明這兩個性狀可以通過遺傳方法進行改良。

遠端上游元件結合蛋白屬于單鏈DNA結合家族，家族成員為FUBP1、FUBP2和FUBP3。FUBP3是一種蛋白質編碼基因[13]。有研究表明，FUBP3可結合并促進β-肌動蛋白mRNA在成纖維細胞的定位[14]，且FUBP3與杜洛克豬的骨骼形成有關[15]。FUBP3是與豬肌肉發育和肉質性狀相關的重要候選基因[16]，也是影響眼肌面積的候選基因[17]。泛素特異性蛋白酶(USPs)也稱去泛素酶，它是最大的泛素酶亞家族[18-19]。其成員USP43可識別并水解泛素C-末端甘氨酸處的肽鍵，參與多泛素前體及泛素化蛋白的加工[20]。Luo等[21]發現，USP43基因內含子內的SNP與多個肉品質性狀顯著相關。

北京黑豬是20世紀60年代由大白、巴克夏和中國地方豬種雜交形成的地方豬種[22]，有著豐富的遺傳背景[23]。本研究通過對FUBP3和USP43基因進行突變位點檢測，并開展基因型與眼肌面積性狀(5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積)的關聯分析，以期為今后北京黑豬眼肌面積性狀的選育工作提供有效的分子輔助標記。

1 材料與方法

1.1 組織樣品及表型數據收集

通過硫酸紙記錄408頭北京黑豬的5～6肋眼肌面積及最后肋眼肌面積輪廓，用聯想M700掃描儀以300像素進行掃描，隨后用PS2020選中眼肌面積輪廓所得到的像素值除以標準像素值即可算出實際眼肌面積。其中北京黑豬中所有公豬均被閹割，母豬占比53%，公豬占比47%。屠宰隨著商業生產進行，170～280日齡，動物均飼養于北京黑六牧業科技有限公司。

1.2 DNA提取

用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)從組織樣品中提取基因組DNA，隨后通過超微分光光度計(IMPLEN)檢測其DNA濃度，用2%的瓊脂糖凝膠進行DNA質量評估并將質量合格的DNA樣品放于-20 ℃保存。

1.3 RNA提取及cDNA的合成

對組織樣品進行研磨，通過RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)按照說明書步驟進行RNA提取，隨后通過超微分光光度計(IMPLEN)檢測其RNA 濃度。對于合格的RNA，用反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)按說明書步驟進行反轉錄，并對合格后的樣品保存備用。

1.4 引物設計及聚合酶鏈式反應(PCR)

利用Primer Premier 5.0對FUBP3(NC_010443.5)、USP43(NC_010454.4)基因共設計43對引物，引物設計后由北京六合華大基因科技有限公司合成，部分引物見表1。

對408頭北京黑豬使用96孔板采用25 μL反應體系進行PCR擴增，反應體系如下：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，聚合酶0.5 μL, DNA 1 μL，dNTP 0.5 μL,上、下游引物各 1 μL, RNase-free水 8.5 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，35個循環；72 ℃延伸2 min。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京六合華大基因科技有限公司平臺進行雙向Sanger測序。

表1 PCR引物信息

1.5 引物設計及熒光定量PCR

利用Primer Premier 5.0對FUBP3的 rs701769847G>A位點和USP43的 rs323463345G>A位點共設計2對引物，引物設計后由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物見表2。

取反轉錄后的cDNA，采用熒光定量試劑盒(TaKaRa TB Green)進行定量。以GAPDH基因為內參，用FUBP3及USP43基因定量引物分別擴增FUBP3和USP43的基因片段。每個樣品設3個重復，20 μL反應體系：2×qPCR Mix 10.4 μL，上下游引物共0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。PCR反應條件為：95 ℃，30 s為模板的預變性階段；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環為模板的擴增階段；60～95 ℃，以每10 s緩慢升溫0.5 ℃建立熔解曲線階段。

表2 RT-qPCR引物信息

1.6 數據統計分析

將測序結果使用DNAStar中的SeqMan進行比對分析，篩選突變個體的基因型。隨后利用Microsoft Excel 2016軟件進行各位點的等位基因頻率和基因型頻率的統計。使用SAS 9.4分析眼肌面積性狀(5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積)和基因型的關聯性，采用Duncan’s多重檢驗用于評估不同基因型之間差異的顯著性，數據使用“最小二乘均值±標準差”表示，P<0.05判定為差異顯著。

2 結 果

2.1 表型數據整理

對408頭北京黑豬的5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積進行分析，發現最后肋眼肌面積均值大于5～6肋眼肌面積。其中5～6肋眼肌面積均值為17.63 cm2，最大值為30.48 cm2,最小值為10.45 cm2。最后肋眼肌面積均值為31.41 cm2，最大值為49.15 cm2，最小值為19.64 cm2(表3)。

2.2 FUBP3和USP43基因多態性檢測及群體分布

通過對FUBP3及USP43基因進行PCR擴增后共發現15個突變位點(表4和表5)，分別位于啟動子區、CDS和剪切區。其中FUBP3中有8個啟動子區域突變和1個同義突變；USP43基因中有1個啟動子區域突變，1個錯義突變，1個剪切區突變和3個同義突變。這15個SNPs的基因型頻率變化范圍為1%～88%，其等位基因頻率變化范圍為6%～94%。

表3 5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積性狀的表型值統計

2.3 FUBP3、USP43基因多態性和眼肌面積性狀的關聯分析

將FUBP3和USP43基因通過PCR擴增篩選的11個SNPs位點(FUBP3上8個啟動子區突變；USP43上1個啟動子區突變，1個錯義突變，1個剪切區突變)與北京黑豬的5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積與基因型的關聯分析結果見表6、表7。FUBP3的8個啟動子區突變中rs701769847G>A與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積都顯著關聯，rs325550799T>C、rs339464012T>C和rs326069041T>C與最后肋眼肌面積關聯顯著，與5～6肋眼肌面積關聯不顯著，rs332131528C>G與5～6肋眼肌面積顯著相關，與最后肋眼肌面積不相關，其余3個(rs335466858A>G、rs322433355C>A、rs346300986A>T)與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積關聯均不顯著。在USP43上位于啟動子區rs335310752C>T和剪切區突變rs323463345G>A與最后肋眼肌面積關聯顯著，與5～6肋眼肌面積關聯不顯著，錯義突變 rs330703352A>G與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積關聯均不顯著。

表4 北京黑豬FUBP3的基因型頻率及等位基因頻率統計

表5 北京黑豬USP43的基因型頻率及等位基因頻率統計

表6 FUBP3基因SNPs與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積性狀的關聯分析

(轉下頁 Carried forward)

表7 USP43基因SNPs與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積的關聯分析

2.4 FUBP3 rs701769847G>A位點和USP43 rs323463345G>A位點基因表達差異分析

根據rs701769847G>A位點基因型的不同分為眼肌面積較大的GG型和較小的AA型北京黑豬個體，隨后利用RT-qPCR技術檢測了FUBP3基因在4頭GG型個體和4頭AA型個體中的表達情況。定量結果顯示，AA基因型個體的FUBP3表達量顯著高于GG型個體(P<0.05)，見圖1。

根據rs323463345G>A位點基因型的不同分為眼肌面積較大的AA型和較小的GG型北京黑豬個體，隨后利用RT-qPCR技術檢測了USP43基因在3頭AA型和5頭GG型個體中的表達情況。定量結果顯示，USP43基因在GG型和AA型個體中差異不顯著，見圖2。

*. P<0.05。下同*. P<0.05. The same as below圖1 FUBP3基因相對表達量Fig.1 Relative expression of FUBP3 gene

圖2 USP43基因相對表達量Fig.2 Relative expression of USP43

3 討 論

眼肌面積在決定胴體瘦肉率方面起著重要作用[24]，且遺傳是影響眼肌面積最主要的因素[1]，所以在遺傳層面的研究是非常有必要的。Rohrer和Keele[25]研究發現，SSC1上的QTL對眼肌面積有顯著影響。有研究表明，通過全基因組關聯分析發現SSC1上的FUBP3是影響眼肌面積性狀的候選基因[17]。Wang等[26]通過對中國青峪豬和長白豬進行DNA甲基化分析發現FUBP3被鑒定為可能與肉質性狀相關的候選基因。FUBP3也有促進細胞增殖的作用，Brauckhoff等[27]研究發現FUBP3可加快肝癌細胞的增殖，且它在肝癌細胞中的高水平表達與患者存活率的下降顯著相關。FUBP3的結合基序(UAUA/UAUG)最近已被確定[28]，而該基序存在于β-actinmRNA 下游460 nt 的3′UTR，包含該基序的79 nt區域被FUBP3結合。Mukherjee等[14]研究也表明，FUBP3的敲除會導致β肌動蛋白的增加。而β肌動蛋白是肌肉細絲及細胞骨架微絲的主要成分，與細胞生長和細胞遷移有關[29-32]。根據上述報道推測，FUBP3可能通過調控β肌動蛋白從而調控肌肉細胞的生長。本研究在北京黑豬群體中對FUBP3基因的8個位點與眼肌面積性狀(5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積)進行關聯分析，結果發現rs701769847G>A位點與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積都顯著相關，rs325550799T>C、rs339464012T>C和rs326069041T>C位點與最后肋眼肌面積顯著關聯，但與5～6肋眼肌面積相關不顯著，而rs332131528C>G位點與5～6肋眼肌面積關聯顯著，與最后肋眼肌面積關聯不顯著，rs335466858A>G、rs322433355C>A、rs346300986A>T位點則對5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積無顯著影響?；虮磉_差異分析表明，rs701769847G>A中FUBP3基因mRNA水平GG基因型個體顯著低于AA基因型個體(P<0.05)。

泛素特異性蛋白酶(USPs)在腫瘤形成和發展中具有重要作用。之前的研究表明，USP43在乳腺癌中是一種H2BK120脫泛素酶和潛在的腫瘤抑制因子，USP43和EGFR/PI3K/AKT之間相互抑制，從而抑制乳腺癌的發生[33]。此外，USP43可以通過調節乳腺癌的細胞周期和EMT過程來促進腫瘤發生[34]。USP43基因在一些癌癥類型中高表達，如骨肉瘤[35]和結直腸癌[20]。許多USP成員參與肌肉的形成與發育[36]，比如USP15參與調節SLIM1的轉錄翻譯，從而調控心肌的肥大反應，這在肌病和心肌病的發病機制中發揮了重要作用[37]。USP14在骨骼肌萎縮的情況下可以被誘導到高水平[38]，USP2亞型的過量表達可以調節肌肉細胞的分化進程[39]。USP19在嚙齒動物萎縮肌肉中的mRNA表達量增加[40]，而USP19缺失會導致主要的肌原纖維蛋白水平增加[41]。雖然目前沒有文獻直接報道USP43對于肌肉發育形成的作用機制，但是已經有研究發現USP43基因也是影響多個肉品質性狀(肌內脂肪、大理石紋、水分，肉色等)的候選基因[21]。從而推測，USP43能促進肌肉的生長發育。本研究在北京黑豬群體中對USP43基因的3個位點與眼肌面積性狀(5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積)進行關聯分析，結果發現rs335310752C>T和rs323463345G>A與最后肋眼肌面積顯著關聯，與5～6肋眼肌面積相關不顯著。而rs330703352A>G與5～6肋眼肌面積和最后肋眼肌面積均相關不顯著?；虮磉_差異分析表明，rs323463345G>A中GG和AA基因型個體的USP43基因mRNA水平差異不顯著。

4 結 論

通過使用408頭北京黑豬對FUBP3和USP43基因進行多態性探索及與眼肌面積性狀關聯分析，共發現15個SNPs，其中FUBP3、USP43上共有2個位點與5～6肋眼肌面積顯著相關，6個位點與最后肋眼肌面積顯著相關，其中FUBP3 rs701769847G>A中FUBP3基因mRNA水平GG基因型個體顯著低于AA基因型個體(P<0.05)。以期探索調控性狀變異的候選基因功能位點，為進一步闡釋性狀變異的遺傳機理奠定基礎。