慢傳輸型便秘動物模型構建方法的研究進展▲

范明明 林 偉 韓海瑞 張嘉裕 王 順

(黑龍江省中醫藥科學院,黑龍江省哈爾濱市 150000)

【提要】 慢傳輸型便秘是一種常見的功能性便秘，腸道傳輸功能受阻、腸內容物阻滯、傳輸時間延長為其疾病特點，其發病機理目前尚未完全明確，需要借助穩定可靠的動物模型進行深入研究。近年來有學者通過單因素、雙因素、復合因素等方法成功制備大鼠、小鼠等慢傳輸型便秘動物模型。本文對近年來慢傳輸型便秘動物模型的常用構建方法的相關研究進行綜述。

功能性便秘是一類需要排除器質性腸道病變、全身系統性疾病及藥物引起繼發性便秘的常見功能性腸病，臨床表現以排便困難、排便不暢、排便時間延長或排便次數減少為主，且不滿足腸易激綜合征的診斷標準。臨床上功能性便秘可分為慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)、出口梗阻型便秘和混合型便秘。STC是功能性便秘中發病率較高的便秘類型，又稱結腸無力[1]，主要以結腸蠕動能力減弱、傳輸能力下降、傳導時間延長為特點[2]；臨床表現主要有排便顯著困難、排便次數明顯減少、便意感減弱或消失伴腹脹、病情反復發作等[3]。流行病學調查顯示，我國功能性便秘患病率約為3.8%[4]，STC患者占功能性便秘患者的 45.5%[5]。目前，STC 的病理生理機制尚未完全清楚，治療方法尚未形成統一標準，且療效欠佳，患者病情易反復，可不同程度地降低患者的生活質量。有研究表明，STC患病率隨年齡的增長而升高[6]，輕者伴有焦慮、抑郁等癥狀[7]，重者常可出現急性腸梗阻、腸壞死穿孔、心腦血管疾病等[8]，該病已經成為嚴重影響人們日常生活的消化系統疾病之一。

根據STC的臨床特點，中醫學將其歸屬為“便秘”。《素問》云“大腸者，傳道之官，變化出焉”，飲食入胃，經脾胃運化、小腸泌別清濁，糟粕下輸大腸而形成大便。若平日喜食辛辣、酒及厚味，日久腸胃積熱,傷津耗氣；平素情志抑郁善嘆息，久則氣機郁滯，大腸傳導無力；素體虛弱，或病后、產后及年老體虛之人，陰虛內燥，血虛不潤，陽虛不煦，腸道濡養溫煦不足，日久大便艱澀難下[9]。該病病位在大腸，與肺肝脾腎密切相關。中醫藥治療STC具有耐受性好、療效可靠、副作用小等優點。為明確中醫藥治療STC的機制，需要運用西藥聯合中醫證候因素建立穩定可靠的中醫證候STC模型。本文分別從西醫、中醫的角度對近年來采用單因素、雙因素、復合因素等方法建立STC模型的研究進展進行綜述。

1 單因素造模方法

1.1 洛哌丁胺法 外周阿片受體激動劑洛哌丁胺可減慢胃腸蠕動，延長腸內容物排出時間，上調大鼠結腸黏膜水通道蛋白4、水通道蛋白8的表達水平，促進腸腔內水的吸收，且不易透過血腦屏障而無明顯抑制中樞神經系統的作用。鄭舒澤等[10]以濃度為0.6 mg/mL的鹽酸洛哌丁胺按10 mL/(kg·d)的劑量給予小鼠灌胃，2次/d，連續給藥7 d后，小鼠出現首粒黑便排出時間延長、排便粒數減少等表現，小鼠結腸黏膜層上皮細胞破損或缺失，杯狀細胞減少，固有層及黏膜下層輕度炎性細胞浸潤，肌層明顯變薄，提示造模成功。此法所建立的STC模型穩定可靠且安全，不易造成動物死亡。

1.2 復方地芬諾酯或復方苯乙哌啶法 復方地芬諾酯與復方苯乙哌啶均由鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品按比例混合而成,可興奮胃腸道平滑肌,減弱結腸蠕動,延遲腸內糞便排出,促進腸內水吸收,減少腺體分泌,起到止瀉作用,且可導致便秘[11]。萬葉敏等[12]將雌雄大鼠分籠適應性飼養7 d后，給予大鼠自由飲水的同時，給予含有復方苯乙哌啶的飼料按8 mg/(kg·d)飼養,連續喂養120 d,制備STC模型，每隔5 d記錄大鼠糞便粒數及含水量、大鼠體重；造模結束后，大鼠精神萎靡，活動減少，皮毛枯槁少光澤，進食及飲水量減少，體重增長緩慢或停止增長，糞便粒數明顯減少，糞便小而干硬伴有黑便，提示造模成功。采用此法制備STC模型，耗時周期較長，但模型穩定，不易反復。

1.3 嗎啡法 阿片類藥物作用于胃腸μ受體是產生阿片類藥物相關便秘的重要原因[13]。嗎啡與胃腸μ受體結合阻礙乙酰膽堿的釋放，進而使腸道平滑肌收縮功能減弱，并使各種消化液的分泌受到抑制,腸道對水的吸收增加,肛門括約肌收縮增強導致便秘[14]。許海塵等[15]對適應性喂養3 d的小鼠給予2.5 mg/(kg·d)的鹽酸嗎啡皮下注射，連續注射45 d，以小鼠平均每日糞便重量減輕、腸道推進率下降作為STC模型制備成功的判斷標準。此方法較為常用，但嗎啡有明顯的呼吸抑制作用，具有一定的安全隱患。

1.4 瀉劑結腸法 大黃水煎劑中的結合型蒽醌苷是大黃瀉下機制中的主要成分，可被大腸中的細菌酶水解為游離型大黃酸蒽醌和大黃酸[16]，長期服用大黃等瀉劑可導致結腸神經系統紊亂和相應的功能缺失，對瀉劑的反應性降低，阻礙結腸蠕動功能，形成“瀉劑結腸”[17]，其是STC的一種重要類型。黃偉等[18]采用含大黃素的飼料喂養小鼠,以100 mg/(kg·d)為初始劑量，隨后每日劑量增加1倍,增至800 mg/(kg·d)時約一半的小鼠出現稀便,然后維持此劑量至稀便完全消失；再以1 600 mg/(kg·d)為起始劑量,日增1倍，最終劑量為6 400 mg/(kg·d)并循環3次，整個療程共82 d，成功建立STC模型。貢鈺霞等[19]對黃偉等[18]的STC造模方法進行改良，以濃度為20 mg/mL的大黃酸液給予大鼠灌胃，第1循環給予12 mL/kg大黃酸液灌胃，隔日1次，直至80%的大鼠稀便消失；第2循環灌喂5 d停2 d，劑量及用法同第1循環，直至80%的大鼠稀便消失；第3循環再給予16 mL/kg大黃酸液灌胃，灌喂5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失。第3循環結束后給予16 mL/kg大黃酸液持續灌胃 1 周，以腸道推進率降低作為STC大鼠造模成功的標準。上述研究結果表明，大黃灌胃制備STC模型具有簡便易行、模型穩定等優點，且大黃價格低廉、來源廣，便于獲取。然而，相較于大黃酸制備STC模型，大黃灌胃的劑量不確定性較大，造模后期易導致動物出現水電解質紊亂、免疫力下降等[20]。目前，對于采用大黃水煎劑或大黃酸灌胃構建的STC動物模型的灌胃劑量、灌胃階段、各階段持續時間等尚未達成共識。

1.5 冰水灌胃法 有研究報告，冰冷鹽水刺激可導致小鼠空腸、回腸和近端結腸肌層神經叢的腸神經系統發生變化，根據該原理制作的動物便秘模型，即使終止冰水刺激后，亦具有一定的穩定性[21]。此外，5-羥色胺4受體可以促進豚鼠回腸平滑肌松弛，冷水刺激后胃腸平滑肌細胞內一氧化氮含量增加，進而上調5-羥色胺表達減緩腸的蠕動[22]。林強等[23]采用0 ℃～4 ℃的生理鹽水給予大鼠灌胃，2 mL/次， 1次/d，連續14 d，構建STC大鼠模型，以大鼠結腸縱行肌收縮幅度、頻率下降和結腸推進率降低作為建模成功的標準。該方法建立的STC大鼠模型出現皮毛枯槁、畏寒少動、神情呆滯等癥狀，與中醫陽虛證基本相符。冰水造模簡便易行，但實驗周期較長且模型不穩定，故在中醫藥治療STC的研究中已較少采用。

2 雙因素造模方法

2.1 嗎啡法+耗氣傷津法 嗎啡皮下注射可以阻礙乙酰膽堿的釋放，從而抑制胃腸道平滑肌細胞收縮。林仁敬等[24]先給予大鼠皮下注射2.5 mg/kg 的鹽酸嗎啡，1次/d，連續注射45 d，同時在皮下注射鹽酸嗎啡15 d后，給予配方顆粒(組方為青皮、枳殼、附子)按13.0 g/kg灌胃，1次/d，連續灌胃30 d，以制備STC模型。造模結束后，大鼠表現出少動、皮毛枯黃無光澤、舌質淡略胖大、少津、排便次數減少、顆粒粗大且硬等情況，解剖見結腸中糞便呈串珠狀或球狀，質地干硬，提示成功建立氣陰兩虛型STC模型。造模所用的配方顆粒組方中的青皮、枳殼可破氣耗氣，且附子可燥熱傷陰，長期服用易傷津耗氣，采用該法建立STC模型符合氣陰兩傷的臨床表現。

2.2 復方地芬諾酯+白醋法 中醫有“味過于酸,脾氣乃絕”及“欲令脾實,食勿太酸”等理論，過食酸味，易致脾虛則水濕不運，易脾陽而致陽虛。復方地芬諾酯中的鹽酸地芬諾酯可直接作用于腸平滑肌，消除局部黏膜的蠕動反射進而減弱腸蠕動，同時增加腸的節段性收縮并促進腸道內水分吸收；而阿托品可減慢腸道蠕動，抑制腸液分泌。霍黎生等[25]將大鼠適應性飼養6 d后，于造模前1 d禁食不禁水24 h。造模期間，上午先給予2.0 mg/100 g復方地芬諾酯灌胃,間隔6 h后給予1.0 mL/100 g的山西白醋灌胃，1次/d，連續15 d，制備大鼠STC模型。以大鼠體重下降、大便粒數減少及含水量降低、小腸推進率下降為建模成功的判斷標準；結果顯示造模結束后,大鼠出現皮毛枯槁且少光澤、活動減少、倦怠嗜臥、反應遲鈍、 食少 、消瘦的癥狀，符合中醫陽虛表現。采用該法建立的STC模型具有復制簡單、實用、經濟、穩定等優點。

2.3 鹽酸洛哌丁胺+氫化可的松法 鹽酸洛哌丁胺可抑制腸道蠕動，促進腸道內水分吸收，進而導致便秘。糖皮質激素通過抑制下丘腦-垂體-靶腺軸，進而抑制促腎上腺皮質激素的釋放，從而使大鼠出現畏寒肢冷、精神不振、被毛疏松少光澤等癥狀[26]。白克運等[27]給予大鼠3.0 mg/kg洛哌丁胺懸液灌胃，并給予氫化可的松注射液25.0 mg/(kg·d) 后肢肌肉注射，連續21 d，以大鼠首粒黑便排出時間延長為陽虛型STC模型制備成功的判斷標準。采取該法建立的STC模型符合中醫學陽虛的臨床表現，且所制備的陽虛型STC模型具有易于控制、成模時間短等優點。

2.4 復方地芬諾酯+自身糞便法 用小鼠自身糞便研磨后灌胃，可引起小鼠急性細菌性腹膜炎,造成腸道動力障礙而引起便秘，多用于胃腸積熱型便秘的造模。復方地芬諾酯可抑制腸道蠕動收縮，促進腸內水分的吸收與抑制腸液分泌，進而導致便秘。鄭豐杰等[28]取小鼠糞便少許加生理鹽水制成0.1 g/L的混懸液，按1.0 mL/只對小鼠進行灌胃，1次/d，連續3 d；于第5～7天，再給予2.0 mg/kg的復方地芬諾酯灌胃，0.3 mL/只，1次/d，連續3 d，制備小鼠STC模型；造模后小鼠皮毛枯黃毛躁、無光澤，精神倦怠、活動減少、食少、糞便少而硬，表明STC造模成功。該胃腸積熱制備法取材便捷、模型簡單，但應注意動物自身糞便宜臨用現配。

2.5 復方地芬諾酯+限水法 復方地芬諾酯中的鹽酸地芬諾酯可抑制腸道收縮，促進腸內水分的吸收，而阿托品可抑制腸液分泌，減弱腸道蠕動進而導致便秘。因此，復方地芬諾酯可導致機體津液耗損，使胃腸失于濡潤，“無水則舟難行”，大便艱澀難出。馬雪巍等[29]采用10.0 mg/kg的復方地芬諾酯加4.0 mL生理鹽水制成濃度為50%的復方地芬諾酯混懸液，并對大鼠進行限水處理，即給予正常飲水量的1/3，約10.0 mL/d；每日給予大鼠灌胃4次，第 1 次灌胃復方地芬諾酯混懸液3.0 mL，其余3次分別灌胃超純水2.0 mL、3.0 mL、2.0 mL，連續灌胃7 d；造模后大鼠糞便干硬量少、呈褐色顆粒狀，精神倦怠，活動明顯減少，毛發枯槁少光澤，體質量增加不顯著，提示津虧型STC模型制備成功。該建模方法限制水的攝入，使得脾胃無生化之源，津液匱乏，不能濡養機體，可導致機體出現口干、皮膚干燥、毛發枯槁、大便干燥量少等癥狀，基本符合中醫學的津虧證型。限水法所制備的津虧型STC雖然具有操作簡單、造模周期短的優勢，但模型穩定性較差。

2.6 復方地芬諾酯+酒精擦拭尾部法 慢性失血，血不養神則精神疲憊、少動嗜睡，體質量緩慢增長，血不養發則皮毛枯槁，血為氣之母，失血日久氣血俱虛則鼻唇淡白，耳尾蒼白而發涼。呂艷鋒等[30]以1.875 mg/kg的復方地芬諾酯連續灌胃小鼠30 d，同時于灌胃首日下午，用 75%乙醇棉球擦拭小鼠尾部，待血管擴張充血后，剪去小鼠尾尖端0.25～0.30 cm，將尾傷口浸入37 ℃溫水中，直至小鼠失血0.15～0.20 mL；每5 d放血1次，共放血6次，以首次黑便排出時間延長，精神萎靡，蜷縮，耳、鼻、唇、尾蒼白為血虛證STC模型成功的標準。該血虛證動物模型雖可在短時間內制備完成，但不能觀察動物舌脈象，其是否完全符合中醫血虛證還需深入研究，且造模過程中難以控制失血量，易出現傷口感染等情況。

3 復合因素造模方法

飲食失節、脾失健運可影響小腸傳導功能，津虧水少不能潤澤腸道則出現食滯、便秘等癥狀；脾氣不濡，精微不散，則毛發枯槁無澤，精神倦怠。夏旭婷等[31]以20.0 g/(kg·d)的番瀉葉灌胃小鼠7 d，造成脾虛狀態，其間小鼠正常飲食、飲水；第8天停用番瀉葉，采用飲食失節方法維持脾虛狀態，采取隔日給予低纖維飼料，生大米6 g，每日飲水1次(30 min)，持續8 d，制備脾虛證STC小鼠模型。造模后，小鼠出現精神疲憊，易怒，毛發疏松少光澤，部分拱背、脫肛，活動少，進食減少，排便次數減少，糞質干且少等表現，表明造模成功。番瀉葉配合飲食失節制備脾虛型STC小鼠模型，切合中醫久泄致虛、飲食不節傷脾胃致脾虛的理論，具有操作簡單、可重復性強的優點，但番瀉葉劑型的選擇、造模總體時間等需進一步明確。

4 STC模型造模成功的判斷方法

4.1 一般狀態的觀察 主要通過觀察實驗動物體質量、糞便性狀、日排便量、糞便含水量等一般情況的改變，評估模型是否符合傳輸時間延長、大便干燥、排便困難等STC模型的特點。

4.2 結腸傳輸功能的測定 造模結束后，通過灌胃活性炭記錄首粒黑便排出時間或計算碳末在結腸內推進長度，進而計算結腸推進率，如結腸傳輸功能減弱，與STC臨床特點相符，則可判斷為STC模型造模成功。

4.3 Cajal間質細胞的檢測 Cajal間質細胞廣泛分布于腸道黏膜下層、肌層，在腸神經系統與胃腸道間起橋梁作用，傳遞腸神經元的興奮性和抑制性神經信號，調控胃腸道運動。病理學研究顯示，STC患者乙狀結腸壁內Cajal間質細胞數量顯著減少，這可能是STC發生的重要機制[32]。造模結束后，對結腸標本進行染色,顯微鏡下觀察Cajal間質細胞的數量變化及形態學變化,可以驗證模型是否成功構建。

5 小 結

STC病因病機未明，目前缺乏特異性的治療方法，患者癥狀反復。近年來，學者們通過多種方法復制便秘動物模型,但是符合STC特點的造模方法不多。大多數中醫藥實驗研究通過單一藥物(洛哌丁胺、復方地芬諾酯、嗎啡、大黃等)或物理刺激(冰水)制備STC動物模型，缺少STC中醫證型的復制因素；制備STC動物模型時，在藥物劑型、藥物劑量、給藥途徑、給藥持續時間等方面缺少統一的標準；各種造模方法在模型穩定性、操作便捷性上存在一定差異，如何構建穩定性好、操作簡單的動物模型有待進一步研究。