糖 尿 病 腎 病 動 物 模 型 的 研 究 進 展▲

劉丹寧 黃國東 楊鑫勇

(廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院1 腎病科,2 腦病科，廣西南寧市 530000)

【提要】 糖尿病腎病是糖尿病嚴重且常見的微血管并發癥之一，目前仍缺乏有效的特異性治療方法，且缺乏良好的實驗動物模型，目前糖尿病腎病主要的造模方法有誘發性、自發性、轉基因法等方法，還有結合中醫理論而建立的病證結合模型法，常見病證包括氣虛證、氣陰兩虛證、血瘀證、陽虛證等。中醫藥在治療糖尿病腎病上具有獨特優勢，但其機制機理目前尚不十分明確，因此研發理想的糖尿病腎病動物模型對于研究糖尿病腎病的病因、發病機制、干預措施，以及防治終末期腎臟病具有重要意義。本文對近年來國內外關于糖尿病腎病模型動物的選擇、造模方法及模型成功的判定指標進行綜述。

糖尿病是由于胰島素分泌相對或絕對不足、靶細胞胰島素敏感性下降或胰島自身結構缺陷而導致代謝紊亂的慢性疾病[1-2]。持續性高血糖、胰島素抵抗和脂代謝紊亂可導致糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病(diabetes nephropathy,DN)、糖尿病足和周圍神經病變等一系列并發癥，DN是糖尿病嚴重且常見的微血管并發癥之一，也是終末期腎病和腎衰竭的主要原因之一，全球疾病負擔調查結果顯示，2017年全球糖尿病患者人數約為4.51億，預計到2045年還將增加2.42億，男性和女性DN的年齡標準化患病率分別為15.48/1 000和16.50/1 000[3-4]。目前對DN的治療尚缺乏特異性的、有效的方法。中醫學并無 DN 之病名，多將其列入“消渴”“水腫”“脹滿”等的范疇。而隨著中醫藥在治療DN上的優勢愈發突出，建立良好的病證結合的DN實驗動物模型對于研究中醫藥治療DN的機制，以及推動中醫及中西醫結合治療DN的方藥、藥理的研究進展具有重要意義。理想情況下，病證結合的DN實驗動物模型應具有與人類相似的臨床狀態特征，并且能夠在整個穩定的慢性病理生理進化過程中檢測血流動力學和生化參數的變化。然而，雖然有關建立病證結合的DN動物模型的研究取得了重大進展，但現有的病證結合的DN動物模型仍不能完全反映人類DN的病理和病理生理變化[5]。本文就近年來國內外關于DN實驗動物模型的選擇、造模方法及建模成功的判定指標進行綜述。

1 DN實驗動物模型

目前DN的發病機制還不完全明確，理想的DN動物模型不僅要能模擬DN的發生、發展,而且對藥物的反應也需要與人類相似。目前，DN動物模型的構建方法主要包括誘發性、自發性、轉基因法三類方法，自發性及轉基因實驗動物模型來源有限，價格昂貴，對飼養和繁殖條件要求較高，因此，藥物誘發性DN動物模型是目前最常用的造模方法。

1.1 實驗動物的選擇

1.1.1 DN小鼠模型：自20世紀80年代以來，隨著小鼠胚胎干細胞技術和基因敲除技術的出現，使得小鼠逐漸取代大鼠成為醫學實驗中建立DN模型最常用的動物。最新研究表明，將C57BL/6J小鼠的瘦素受體基因敲除后可得到db/db小鼠模型，單側腎切除術后的db/db小鼠模型表現出早期DN的臨床特征，可以用于DN病情初期進展機制的研究[6-7]。

非肥胖糖尿病(non-obesity diabetes，NOD)小鼠模型是目前最常用的1型糖尿病自發性模型[8]。C57BL/6J小鼠是研究DN最常用的品系，許多自發性DN小鼠都是由該品系基因突變而成的。有學者發現，與C57BL/6J小鼠相比，從高脂飲食喂養的第4周開始，KK-Ay小鼠的脂質代謝指標(總膽固醇、三酰甘油、LDL-C)水平明顯高于C57BL/6J小鼠，兩組的差異在高脂飲食喂養第12周時最顯著，而在高脂飲食喂養的第16周后，KK-Ay小鼠脂質代謝指標(總膽固醇、三酰甘油)水平仍明顯高于C57BL/6J小鼠[1]。有學者在糖尿病db/db小鼠與C57BL/KsJ小鼠的基礎上研究出一種具有內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)完全遺傳缺陷的小鼠系,這種新型的eNOS-/-db/db C57BL/KsJ小鼠表現出的高血壓、尿白蛋白等癥狀較KK-Ay小鼠更為明顯,同時出現廣泛的腎小球系膜基質擴張、腎小球膜炎、腎小球基膜增厚、小動脈透明變性和腎小管間質纖維化等與人類DN相似的病理表現。研究表明，與鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導的空腹血糖升高或僅胰島素抵抗的SD大鼠相比，空腹血糖和胰島素抵抗性均較高的KK-Ay小鼠更容易發展為DN，KK-Ay小鼠模型更能表現出與2型糖尿病相關的典型病理特征，其早期表現和腎臟病變更明顯[1]。

在DN疾病進展過程中，DN合并高血壓是DN是發展為終末期腎病的主要危險因素，由于DN動物模型晚期沒有高血壓表現，缺乏存在腎臟病理變化的DN合并高血壓小鼠模型是研發DN新治療方法的一個重大障礙。

1.1.2 DN大鼠模型：研究表明，相比于小鼠，大鼠在認知行為等方面與人類的相似度更高。與小鼠相比，大鼠體型較大，其生理學特征易于觀察，是多種疾病的重要模型動物。DN大鼠造模品系以Wistar和SD為主,6～8周齡，體重在200～250 g之間[9]。生物繁殖大鼠和LEW.1AR1/Ztm-iddm大鼠是目前最常用的1型糖尿病自發性模型[8]。

農慧等[10]主張采用SD大鼠建立糖尿病模型,因為SD大鼠的免疫力強于Wistar大鼠。該團隊研究發現采用相同劑量的STZ進行造模時,Wistar大鼠的死亡率可以達到50%以上，其原因可能是建模后Wistar大鼠的免疫力下降，因此對用于建立糖尿病模型的大鼠等級和飼養環境要求更高。為了研發新的DN大鼠模型，包括美國糖尿病并發癥動物模型協會成員在內的一些研究人員一直在利用遺傳育種等手段加重DN大鼠的病情，使DN大鼠模型的主要特征變得更加明顯，如聯合采用基因模型與高熱量飲食獲得的Zucker脂肪型/自發性高血壓心力衰竭F1雜交(Zucker fatty/spontaneously hypertensive heart failure F1 hybrid，ZSF1)大鼠，是一種常見的糖尿病合并高血壓和肥胖大鼠模型，該大鼠模型可出現高血壓、高血糖、高脂血癥和腎功能不全等表現，且ZSF1大鼠模型與其他DN嚙齒動物模型相比，尤其是與DN小鼠模型相比，最大的區別是其出現顯著的管間質纖維化[5]，這是人類DN的一個關鍵病理特征。

1.1.3 其他動物：鼠類、嚙齒類動物模型并不能完全地反映DN患者的代謝背景與所有的病理改變，疾病的生理機制也不完全相同。因此，新西蘭兔、斑馬魚、小型豬、斑馬魚等亦可作為研究DN的模型動物，且各自有其不可替代的優勢。

DN新西蘭兔模型較DN鼠類模型具有模型穩定、重復性好、抗病性強等優點，且方便進行反復采血、灌胃、靜脈注射藥物等操作，以及進行組織器官影像學檢查[11]。與DN鼠類模型的造模方法不同，DN新西蘭兔模型需禁食水12 h后,經耳緣靜脈注射50 mg/kg四氧嘧啶,隔天禁食水12 h后再次經耳緣靜脈注射100 mg/kg四氧嘧啶(均以注射用水配成5%濃度)，注藥后48 h內給予自由攝取10%葡萄糖水[12],干預后12周，如新西蘭兔腎小球毛細血管袢呈分葉狀,基底膜及系膜基質增生，腎小管部分基底膜增厚,上皮細胞腫脹、顆粒變性，則提示DN模型成立[13]。但相較于DN鼠類模型，DN兔類模型成模率較低，造模過程中死亡率較高[14]，其腎臟形態學變化與DN患者對比未見典型腎小球結節，系膜基質增加及外周毛細血管滲出亦不明顯[15]。

小型豬也是制備2型糖尿病模型的理想動物之一。不論在生理解剖結構、疾病發生機制，還是在糖脂代謝和血液生化指標上，小型豬與人類都有較高的相似度[16]。廣西巴馬小型豬是采用純繁閉鎖繁育及半同胞為主的近交方式進行選育而成的遺傳純和很高的近交群體的小型豬品系，蔣子健等[17]給予廣西巴馬小型豬高脂高糖飼料喂養，并多次經耳緣靜脈注射小劑量(50 mg/kg)STZ，建立了較為理想的DN模型。相較于鼠類模型，小型豬模型在生理結構和代謝機制上更接近于人類，并且有足夠的血液、尿液及腎臟等組織標本供實驗檢測，應用活檢和內窺鏡技術還可以監測腎臟組織的時序性改變，但其造模時間長，造模成本高，僅能模擬DN早期腎臟病變,尚未觀察到腎小管間質纖維化和/或腎功能下降等進展期DN病變。

成年斑馬魚的葡萄糖代謝及在斑馬魚胚胎發育中的葡萄糖代謝情況與人類及其他哺乳動物非常相似，因此，成年斑馬魚是觀察生理和糖尿病條件下器官發育、形態和功能的理想模型。研究表明，生理條件下斑馬魚的血糖水平在3.3 mmol/L左右，可以通過飼喂和空腹進行動態調節[18]。鼠類的高血糖誘導通常是通過單次注射高劑量或連續注射低劑量的STZ來實現的，可在數天或數周內引起高血糖，而在斑馬魚中，注射胰十二指腸同源異型基因1嗎啡利諾誘導高血糖只需要2 d，并且在研究葡萄糖記憶效應機制及支持高吞吐量分析和篩選上，因其繁殖速度快、操作簡便而具有獨特的優勢[18]。

1.2 造模方法 誘發性DN動物模型的建立原理是通過損傷動物的胰島細胞,導致胰島素缺乏從而引起實驗性糖尿病或高血糖，進而引發DN。STZ對肝腎損害較小，可通過葡萄糖轉運蛋白定向破壞胰島β細胞，是近年來建立糖尿病動物模型的首選藥物。

1.2.1 一次性注射大劑量STZ：一次性大劑量注射STZ誘導糖尿病大鼠模型的機制是STZ直接造成胰島β細胞的損傷，因此通常認為該方法所建立的模型為1型糖尿病模型，然而不同種糖尿病動物模型所給予的STZ劑量各有不同，甚至對于同種動物一次性大劑量注射不同劑量的STZ所構建的模型也存在差異。一次性大劑量注射STZ建立DN 大鼠模型所需要STZ的劑量，目前國內外尚未統一，國內研究一般選取45～65 mg/kg[19-21]，而國外則采用70～100 mg/kg[22-24]。葉桐江等[25]研究發現，禁食20 h后一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg為建立1型糖尿病大鼠模型的最佳禁食時間和最優劑量。但農慧等[10]使用55mg/kg的大劑量STZ一次性注射SD大鼠進行造模，并將非空腹血糖水平≥13.8 mmol/L作為建模成功的標準，發現使用一次性注射55 mg/kg STZ的造模周期相對縮短。還有研究表明，單純一次性大劑量注射STZ所建立的模型更接近1型糖尿病患者的代謝狀態，而在大劑量注射STZ基礎上聯合煙酰胺腹腔注射，可以部分保護胰島β細胞免受STZ誘導的損害，能更好地模擬2型糖尿病患者的代謝狀態[26]。

1.2.2 高糖高脂飲食聯合STZ注射：研究顯示，高糖高脂飼料喂養的大鼠表現出與肥胖并前驅糖尿病具有相同的代謝表型，即葡萄糖耐量和胰島素敏感性受損，以及高三酰甘油血癥和脂質過氧化作用；盡管肌酐水平沒有變化，但前驅糖尿病動物仍表現出腎小球月牙樣病變，并伴有腎臟組織油紅-O染色脂質沉積率增加，三酰甘油、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA表達升高[27]。研究發現，高脂高糖飼料(10%豬油+ 20%蔗糖+ 2.5%膽固醇+ 1%膽酸鹽+ 66.5%常規飼料)聯合STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型的STZ最佳劑量為35 mg/kg，建模成功率高且死亡率低，模型穩定；多次注射STZ可激活大鼠免疫系統,誘導胰島的免疫反應,引發胰島炎,該方法所建立的模型被認為是更接近于2型糖尿病患者的動物模型[1，28-29]。有研究顯示，高熱量飲食聯合一次性腹腔注射高劑量(60 mg/kg)STZ誘導4周齡雄性大鼠可建立1型糖尿病和晚期2型糖尿病模型，而高熱量飲食聯合一次性腹腔注射低劑量(30 mg/kg)STZ 誘導4周齡雄性大鼠能更快地形成具有胰島素抵抗的早中期2型糖尿病模型，并能提高成模率[30]。

1.2.3 手術聯合一次性注射STZ：有學者在大鼠耳朵尾巴連線與右肋弓的交界點做一長約1 cm的橫行切口，逐層分離皮膚、黏膜、肌肉，充分暴露右腎后再將其切除，檢查無出血后逐層縫合；術后1周，大鼠禁食不禁水12 h，按40 mg/kg一次性腹腔注射10 mg/mL STZ，建立DN模型，這種方法相對于單純注射STZ，可以顯著縮短造模周期，而相較于三聯法(手術+高糖高脂飲食+小劑量STZ)則操作較簡單，成本較低， DN大鼠模型穩定，且無自愈現象[6,31-32]。

1.2.4 手術+高糖高脂飲食+小劑量注射STZ：單側腎動脈結扎+高糖高脂飼料喂養+小劑量STZ(30～45 mg/kg)腹腔注射的三聯法是目前應用最廣泛的誘發性DN動物模型的制備方法，一般只需要干預3 d即可造模成功，此時可觀察到DN早期的臨床特征及病理表現，建模9周后進入DN中期，建模22 周后進入DN晚期[33]。此三聯法雖然造模時間較短，具有顯著的生化和病理改變，但是存在操作復雜、易感染、死亡率高等缺點，對研究者的實驗操作水平要求較高。

2 病證結合DN模型

DN在中醫中并無特定的名稱，一般多將其歸于“消渴”“水腫”“脹滿”等的范疇，其作為糖尿病的后期并發癥，病程長，多屬本虛標實證。《素問·通評虛實論》中提出消癉、仆擊、偏枯、痿厥等類似糖尿病并發癥的描述，并指出上述疾病發生的病機為“隔塞閉絕，上下不通”。“腎消”一詞首見于《古今錄驗方》，《三因極一病證方論》提及消腎的病位在腎，病機為縱欲過度，腎精不足，又多食丹藥，內熱從生，石氣孤立，導致精溢自泄、唇口干焦、不飲自利，認為消腎的病機為熱伏于下，腎精虧虛。《景岳全書》提到“下消者，……為淋為濁，如膏如脂，……其病在腎，故又名腎消也”，提出腎消的病機為火熱內生、消灼腎陰或陰虛火旺，同時也提出陽虛亦可致消的觀點。由此可知，氣陰兩虛證是糖尿病并發癥證型中最常見的證型，而血瘀證始終貫穿糖尿病的整個病程。病證結合DN模型的建立主要是在建立DN模型的基礎上模擬中醫證型的造模方法。

2.1 氣虛證 樊少儀等[34]根據臨床上部分糖尿病患者由于疲勞和飲食失節導致DN的發生或進一步加重的原理，采用疲勞聯合饑飽失常法建立氣虛證DN模型，將DN成模的大鼠連續14 d放入水溫為(43.0±0.5) ℃ 、水深為35 cm的恒溫水槽中游泳，每天以每只大鼠出現自然沉降的時間為其游泳耐疲勞的時間，當50%的大鼠出現自然沉降時停止游泳。DN氣虛證大鼠模型建模成功的標準：疲勞游泳后測量游泳持續時間及懸掛時間，游泳持續時間及懸掛時間縮短30%以上，大鼠出現明顯精神倦怠，懶動，自發活動減少，皮毛蓬亂無光澤、眼瞇成線和縮肩拱背，糞便稀溏，隨著時間的延長，上述癥狀逐漸加重。

2.2 氣陰兩虛證 李詩[35]采用高糖高脂飼料+腹腔注射STZ的方法建立DN大鼠模型，然后采用具有耗氣破氣功效的中藥顆粒劑(附子10 g、青皮15 g)藥液，根據大鼠體重按15.75 g/(kg·d)連續灌胃給藥4周，4周后大鼠出現明顯的倦怠乏力懶動、嗜蜷臥、善驚恐打斗、被毛色黃晦暗無光、舌胖大少津、舌面光滑無苔等表現，視為氣陰兩虛型DN大鼠模型建模成功。胡正遠[36]采用三聯法(手術+高糖高脂飲食+小劑量STZ腹腔注射)制備DN大鼠模型，成模后以中藥干姜、肉桂、青皮依照1 ∶1 ∶1的質量比例，煎劑濃度為1 g/mL，按體重15 g/(kg·d)連續灌胃4周后DN大鼠出現倦怠乏力懶動、毛發枯黃刺立、舌質紫紅少津等癥狀。李進[37]采用高糖高脂飼料+一次性腹腔注射STZ的方法建立DN大鼠模型后，連續灌胃耗氣傷陰顆粒中藥煎劑的同時附加睡眠剝奪導致大鼠出現緊張、焦慮、勞累、驚恐等表現，共干預4周，成功建立氣陰兩虛證DN大鼠模型。陳群等[38]采用高脂喂養+小劑量STZ建立DN模型大鼠，采用低溫調控手段誘導血瘀證模型大鼠后，再從中篩選出同時具有氣陰兩虛證的大鼠，并予糖脈康顆粒(臨床治療氣陰兩虛夾瘀證糖尿病的經典方藥)反證動物模型，以此得到較為滿意的氣陰兩虛夾瘀證的DN大鼠模型。

2.3 血瘀證 龐欣欣等[39]采用一次性大劑量腹腔注射STZ建立DN大鼠模型8周后，篩選24 h尿蛋白含量≥40 mg的DN大鼠給予尾靜脈注射 10%大分子右旋糖酐，共3次，第 1 次尾靜脈注射后間隔 5 h 后進行第 2 次注射，然后禁食，次日尾靜脈注射第 3 次，2周后大鼠均有皮毛和唇色澤暗淡，眼球暗紅，耳郭及舌下脈絡顏色紫紅、紫暗明顯，爪掌水腫，顏色偏暗等血瘀證表現。還有學者將成模的糖尿病大鼠在16 ℃下飼養4周，以此得到氣陰兩虛夾瘀證DN大鼠模型[36]。

2.4 陽虛型 孫紅旭等[40]采用高糖高脂飼料+2次小劑量腹腔注射STZ建立DN大鼠模型后，選取造模成功的大鼠并給予腺嘌呤及苦寒中藥(龍膽草、梔子、番瀉葉)混合灌胃，得到腎陽虛型DN大鼠模型。李海霖等[41]結合高原地區的地理因素，讓大鼠每日在氣壓減至相當于海拔5 000 m的真空艙內活動3.5 h，隨后放入冰箱冷藏室中，對大鼠進行寒冷刺激3.5 h，共干預35 d，同時按50 mg/kg給予一次性腹腔注射STZ，以此來建立高原陽虛血瘀型DN大鼠模型。

3 DN動物模型成模的標準

既往研究表明，糖尿病大鼠于第8周開始出現腎病蛋白表達異常并逐漸加重， 而腎病蛋白被認為是糖尿病腎損傷早期的標記物[42]。周淑紅等[43]研究發現，在成模后第16周時糖尿病大鼠模型才出現腎臟肥大、高濾過和腎小球基質增生，且尿素氮、血肌酐和腎小球濾過率與DN發生均無相關性，這提示在DN早期檢測尿白蛋白水平并不能完全反映腎臟病理損害變化。

目前糖尿病與DN動物模型成模的標準尚未統一，不同研究的成模標準均不同。常用的糖尿病動物模型成模標準為：注射STZ或者四氧嘧啶等造模藥物72 h后，連續3 d采集尾靜脈血檢測血糖,至少連續3次血糖水平≥16.7 mmol/L，尿糖強陽性[25,42，44]，口服葡萄糖耐量試驗后血糖水平≥11.1 mmol/L[30,45]，24 h尿量多于空白對照組的50%[31]。DN早期的典型特征是腎小球肥厚，腎小球系膜基質中度擴張，腎小球毛細血管壁增厚；隨著病情的發展,腎小球硬化癥是DN的主要病理學特征，表現為腎小球基底膜增厚，系膜細胞和足細胞損失擴張[3,40]。 基于此，美國糖尿病并發癥動物模型協會制定了DN嚙齒動物模型的驗證標準:(1)DN動物模型的整個生存期腎小球濾過率下降50%以上；(2)與相同品系、性別、年齡的對照組相比，尿蛋白增幅超過10倍；(3)腎臟系膜基質增生伴或不伴結節硬化和系膜溶解，基底膜增厚超過基線水平的50%，小動脈透明樣變，小管間質纖維化[46]。

4 小結與展望

目前，鼠類模型仍是大多數研究者構建DN實驗動物模型的第一選擇，最常使用的是STZ聯合高糖高脂飼料或三聯法(高能量飲食+STZ注射+單側或部分腎切除)構建DN鼠類模型，其中db/db小鼠[(30.0±2.5)g]和Wistar大鼠、SD大鼠[(225±25)g]是使用最多的動物，通常使用化學藥物四氧嘧啶或STZ誘導動物糖尿病發病，四氧嘧啶通過選擇性破壞胰島β細胞，使胰島素分泌不足引起血糖升高，但其在早期可造成肝、腎組織中毒性損害；而STZ對肝腎損害較小，可通過葡萄糖轉運蛋白定向破壞胰島β細胞，是目前應該最廣的造模藥物。但是，不論是四氧嘧啶還是STZ，都存在小劑量無效、大劑量致死的問題，用藥劑量是影響造模成功的關鍵因素，而不同的研究者使用的劑量各有不同。同時，大多數動物模型，尤其是小鼠模型，盡管存在蛋白尿/蛋白尿和腎小球病變，但不表現為小管間質纖維化，也不發展為進行性腎功能衰竭。因此，仍然需要進一步研究建模的給藥劑量和規范的DN成模標準。

近年來，中醫病證結合DN動物模型的研究報告仍較少，主要是在DN成模的基礎上，通過動物的皮毛、唇、眼球、耳郭、舌下脈絡、爪掌、尾根顏色等篩查出目標證型，或者予相關證型特點的中藥湯劑灌胃造模，或者根據證型的血流動力學特點注射相關藥物以模擬證型特點。研究更恰當、更準確的病證結合DN動物模型，尋求構建與人類腎臟解剖和生理特征相似特征的動物模型，以求能夠攻破DN發病機制的難點及尋求更好的防治方法，已經成未來DN動物模型研究發展的必然趨勢。