人羊膜修復肌腱損傷的研究進展

王江濤，李春寶，步建立，安明揚，袁 偉，張加廷，肇 剛，朱娟麗，李眾利，劉玉杰

1解放軍總醫院第四醫學中心 骨科醫學部，北京 100853；2 解放軍第 980醫院 骨一科，河北石家莊 050000

肌腱損傷是最常見的臨床疾病之一，占所有損傷性疾病的30%[1]。肌腱粘連、肌腱愈合差導致的再斷裂、腱骨不愈合等嚴重影響肌腱損傷修復術的臨床療效，是尚未解決的難題[2-5]。人羊膜作為一種胚胎源性組織，免疫原性低，富含多種生物活性物質，具有抑制炎癥反應、促進組織修復的潛在作用。近年來，國內外多項研究表明人羊膜在創面修復、神經損傷修復、骨軟骨損傷修復和肌腱損傷修復等方面有重要的作用[6-11]。也有研究報道人羊膜與傳統修復技術相比在肌腱損傷修復的早期并不能產生更好的治療效果[12]。本文旨在通過探討人羊膜在肌腱損傷修復中的作用，為臨床預防肌腱粘連、促進肌腱和腱骨愈合提供參考。

1 人羊膜的結構和功能

1.1 人羊膜的結構 人羊膜是一種胚胎源性組織，厚度為0.02 ～ 0.5 mm，半透明狀，無神經、淋巴管和肌肉[13]。根據解剖位置不同，人羊膜可分為胎盤羊膜、反應羊膜和臍帶羊膜，胎盤羊膜覆蓋胎盤表面，反應羊膜沿子宮壁分布，臍帶羊膜位于臍帶部位[14]。人羊膜主要分為3層結構，內層為上皮細胞層，與羊水接觸，中間層為基底層，外層為間質組織層，與絨毛膜相連。間質組織層由內向外又分為致密層、成纖維細胞層和海綿層[13-15]。上皮細胞層由立方上皮細胞(反應羊膜)或柱狀上皮細胞(胎盤羊膜)構成，與基底層緊密相連，可分泌轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、TGF-β2和表皮生長因子等多種細胞生長因子[14]。基底層致密，厚實，含有大量層粘連蛋白、纖連蛋白和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原蛋白，是保護羊水和胎兒的物理屏障[13,15]。間質組織層含有大量膠原纖維，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型膠原纖維，距離胎盤越近的膠原纖維呈平行排列，距離胎盤越遠的膠原纖維垂直羊膜表面排列[16]。間質組織層內含有間充質干細胞，具有多向分化潛能，是用于組織修復的重要基礎[17-18]。

1.2 人羊膜的功能 人羊膜的功能包括為胎兒提供物理保護屏障、轉運水和可溶性營養物質，調節羊水的酸堿平衡，合成并分泌多種細胞信號和生物活性物質，發揮抗菌、抗感染、防粘連和促修復的作用[13,19-20]。人羊膜分泌的生物活性物質包括成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、血小板源性生長因子、白細胞介素-1、白細胞介素-10等[12,18]。此外，人羊膜還可分泌白細胞介素-1和白細胞介素-10的拮抗劑，以及降解酶的調控物質(TIMPs 1/2/3/4)[20]。人羊膜還可下調TGF-β信號通路，招募成纖維細胞和巨噬細胞，促進膠原纖維生成[20]。反應羊膜比胎盤羊膜表達更多的免疫調節表面活性蛋白-D，具有更大的免疫調節潛能[14]。胎盤羊膜可分泌更多的胰島素樣生長因子1、胰島素樣生長因子b、血管生成素等生長因子，促組織修復功能優于反應羊膜[14]。組織再生修復是一個能量消耗的過程。胎盤羊膜的線粒體活性更高，能產生更高的能量，更適合用于代謝活躍部位的組織修復[21]。

2 人羊膜的保存

根據保存方式的不同，人羊膜可分為新鮮羊膜、低溫冷凍羊膜、凍干羊膜 3種[20,22]。這3 種羊膜均保留了細胞成分和基質成分，羊膜的整體性未被破壞。新鮮羊膜保存時間較短，而且可引起較輕的機體炎癥反應[23-24]。低溫冷凍羊膜保存時間較新鮮羊膜長，但會影響干細胞的活力[25]。為此，需要將羊膜放入10% DMSO或50%甘油溶液中并置于-80℃下保存[25-26]。凍干羊膜對保存的條件要求相對最低，可常溫條件下長期保存[20,22,27]。研究表明，凍干羊膜與低溫冷凍羊膜相比，在細胞活性和基質成分方面無顯著差異，在安全性、保存時間、移植存活率等方面具有優勢，易于處理和運輸[28]。此外，還有一種脫細胞羊膜，它是使用酶消化法、化學去污法和物理刮除等方法，脫去了羊膜上皮細胞或所有細胞成分后的組織形態，免疫原性更低，組織相容性更好，可作為生物支架為細胞轉移、增殖、分化提供所需的生長微環境[29]。

3 人羊膜在肌腱損傷修復中的應用

3.1 預防肌腱粘連，促進肌腱愈合 肌腱損傷后外源性修復系統啟動，炎性細胞浸潤，炎性介質釋放，刺激成纖維細胞過度增生，大量膠原蛋白沉積，進而造成肌腱粘連[30-31]。建立物理屏障，阻斷外源性修復，是預防肌腱粘連的可行途徑。Liu等[31]將人羊膜與人工材料制成多層納米纖維膜，并將其用于預防兔指深屈肌腱縫合修復后的肌腱粘連，結果顯示生物復合羊膜材料可有效隔離外源性修復，增強內源性修復，從而預防肌腱粘連，促進肌腱愈合。Nicodemo等[32]研究了人羊膜在大鼠急性跟腱損傷修復中的作用，結果顯示羊膜能降低炎性反應，增加成纖維細胞增殖，改善膠原纖維排列，從而預防腱周粘連，加速跟腱損傷修復。Sang等[24]對脫細胞羊膜預防肌腱粘連的作用進行了動物實驗研究，結果顯示脫細胞羊膜通過釋放轉化生長因子和成纖維細胞生長因子促進內源性修復系統并阻斷外源性修復系統，從而預防肌腱粘連，加速肌腱愈合的作用。臨床研究方面，一項多中心隨機對照研究顯示，屈肌腱縫合修復后應用人羊膜包裹屈肌腱較對照組可有效增加指間關節的活動范圍，提高關節功能評分[33]。Ang等[34]將人羊膜覆蓋肌腱損傷修復部位預防術后肌腱粘連，隨訪效果良好。但Lepp?nen等[12]報道5例應用羊膜包裹指屈肌腱縫合部位的病例，隨訪中1例患者發生肌腱再斷裂，給予二次修復手術。1例患者出現指間關節黏連僵硬，其余3例患者隨訪結果一般。筆者認為該研究病例數少，且術中所用羊膜已凍存1年，這可能影響羊膜的效能和術后療效。此外，雖然動物實驗顯示人羊膜包裹肌腱可起到預防肌腱粘連、促進肌腱愈合的雙重作用。但臨床研究顯示人羊膜包裹肌腱的主要臨床意義在于預防肌腱粘連，可能有一定的促進肌腱愈合的作用。

除人羊膜包裹肌腱可預防肌腱粘連、促進肌腱愈合外，還有研究顯示顆粒狀或粉末狀人羊膜及人羊膜提取成分也可促進肌腱損傷修復。體外研究顯示胎盤來源的含有顆粒狀羊膜和羊水細胞的異體懸液移植物可顯著增加腱細胞的密度并促進其遷移，增加胞外基質的沉積，下調炎性因子IL-8和轉化生長因子TGF-β1蛋白表達，抑制炎癥反應，從而促進肌腱損傷修復[35]。Ragni等[36]研究顯示人羊膜間充質干細胞可分泌多種細胞因子和趨化因子促進胞外基質重塑，同時分泌多種胞外囊泡微小RNA促進巨噬細胞極化，抑制炎性反應，從而保護肌腱，促進肌腱損傷修復。Li等[37]研究顯示人羊膜間充質干細胞可分化成前交叉韌帶樣細胞，與前交叉韌帶細胞共培養后可明顯增加前交叉韌帶細胞的增殖和分化，促進前交叉韌帶損傷修復。體內研究方面，Barboni等[38]對人羊膜上皮細胞修復羊跟腱損傷進行了研究，結果顯示羊膜上皮細胞通過分泌調節因子抑制炎性細胞浸潤，加速血管形成和胞外基質重塑，同時羊膜上皮細胞可原位分化為肌腱樣細胞，從而促進肌腱損傷修復。De Girolamo等[39]應用人羊膜懸液異體移植修復鼠跟腱的腱病，術后14 d肌腱纖維排列明顯改善，術后28 d肌腱損傷恢復正常。臨床研究方面，一項納入40例肌腱損傷病例的臨床研究顯示，羊膜和(或)絨毛膜粉末注射治療后3個月91%的患者疼痛明顯減輕，功能明顯改善，臨床療效良好[40]。

3.2 促進腱骨愈合 腱骨界面由4 層結構組成，由外到內依次為肌腱(韌帶)、未鈣化纖維軟骨、鈣化纖維軟骨和骨[41]。其中，纖維軟骨負責傳導機械載荷，是腱骨界面損傷的主要部位。由于纖維軟骨無血運、再生能力差，損傷后腱骨愈合困難。如何促進腱骨愈合成為再生醫學關注的焦點問題。Smith等[42]比較了羊膜基質支架、脫細胞真皮移植物和牛膠原支架對部分肩袖撕裂的修復作用，結果顯示3 種移植物的肩袖修復效果均較對照組更好，羊膜基質支架、脫細胞真皮移植物優于牛膠原支架。鄒剛等[43]研究顯示Scleraxis基因轉染人羊膜間充質干細胞可顯著上調韌帶分化相關基因Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、細胞連接素C的mRNA表達水平，從而促進兔跟腱與骨隧道的腱骨愈合。Zhang等[44]研究了脫細胞羊膜復合FGF-2誘導的羊膜間充質干細胞對兔腱骨愈合的作用，結果顯示術后3個月試驗組均較對照組的骨形成量更大，骨隧道直徑、腱骨間隙更小，腱骨交界區有大量纖維軟骨形成，腱骨以直接連接形式愈合，腱骨愈合質量更好。

4 結語與展望

人羊膜在肌腱損傷修復中的作用已在動物體外和體內實驗研究中得到體現，但相關臨床研究相對較少，仍需要高質量的多中心隨機對照研究證實。此外，現有研究主要為人羊膜對跟腱、屈肌腱、前交叉韌帶等肌腱損傷縫合術后肌腱愈合的影響，鮮有人羊膜在肩袖損傷修復方面的報道。肩袖損傷術后再撕裂率可高達13% ～ 94%，應用新材料、新技術后肩袖再撕裂率仍高達20% ～60%[45]。肩袖術后腱骨愈合仍是亟待解決的重難點問題。鑒于人羊膜低免疫原性、富含生物活性物質、無臨床應用倫理問題、來源充足等優勢，可加強人羊膜在肩袖損傷修復方面的研究，以促進肩袖術后腱骨愈合，降低術后再撕裂率。同時，隨著人羊膜相關研究的不斷深入和生物技術的不斷進步，人羊膜將可能成為臨床上解決肌腱韌帶修復和促進腱骨愈合的理想生物材料。