miR-25-3p和ZEB2在宮頸癌中表達的臨床意義及對宮頸癌細胞增殖和侵襲的作用探討

吳小穎，陳彤華，邢增麗，黃 霞，邢雪鳳

1 四川大學華西三亞醫院 婦產科，海南三亞 572000；2 海南醫學院第一附屬醫院 產科，海南海口571000

宮頸癌是全球最致命的婦科惡性腫瘤之一，發病人數逐年增加，且85%的死亡病例發生在發展中國家[1-2]。盡管宮頸癌治療已取得了很大進步，但患者的預后普遍較差[3]。微小RNA-25-3p(microRNA-25-3p，miR-25-3p)是與腫瘤密切相關的miRNA，在子宮內膜癌和三陰乳腺癌等惡性腫瘤中被報道為促癌因子[4-5]；而在食管癌惡性腫瘤中被報道為抑癌因子[6]；在宮頸癌中miR-25-3p通過逆轉上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)增強宮頸癌細胞對順鉑的敏感度[7]。鋅指E盒結合的同源盒蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)屬于結合E-box的鋅指蛋白家族，在腫瘤發生和發展中發揮多種作用[8]。ZEB2在宮頸癌中高表達，并促進宮頸癌的增殖和侵襲能力[9]。miRNA主要是通過調控其靶基因發揮生物學作用[10]。我們采用Target Scan7.1軟件預測ZEB2是miR-25-3p的靶基因，而miR-25-3p能否通過靶向ZEB2在宮頸癌進展中發揮作用尚不清楚。本研究旨在分析miR-25-3p與ZEB2在宮頸癌中表達的臨床意義和相關性，并進一步分析miR-25-3p調控ZEB2在宮頸癌中的作用。

資料與方法

1 研究對象 納入四川大學華西三亞醫院2013年1月- 2014年12月治療的宮頸癌患者84例，獲取病理組織。另收集因良性疾病切除的正常宮頸組織40例作為對照組。所有患者或家屬均簽署知情同意書，本研究由四川大學華西三亞醫院倫理委員會審核通過。納入標準：1)經病理檢查確診患有宮頸癌；2)入組前未進行手術、化療、放療等抗腫瘤治療；3)患者臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：1)患有其他器官原發和轉移腫瘤；2)合并有心、肝、腎等重要臟器功能障礙；3)合并有血液系統疾病、免疫功能障礙。

2 研究對象分組及觀測指標 以實時熒光定量PCR檢測miR-25-3p、ZEB2 mRNA的相對表達量。統計患者5年隨訪資料，隨訪方式為門診復查和電話隨訪，分析患者的5年總生存(overall survival，OS)率。分組設計：1)按照miR-25-3p在宮頸癌組織中平均的相對表達量0.7為界，將84例宮頸癌患者分為miR-25-3p≥0.7高表達組(39例)和miR-25-3p＜0.7低表達組(45例)。2)以ZEB2 mRNA在宮頸癌組織中平均相對表達量1.33為界，將84例宮頸癌患者分為ZEB2 mRNA≥1.33高表達患組(43例)和ZEB2 mRNA＜1.33低表達組(41例)。3)根據ZEB2蛋白在宮頸癌組織中的表達情況將其分為ZEB2蛋白高表達組(48例)和ZEB2蛋白低表達組(36例)。

3 實驗試劑與儀器 TRIzol?試劑，日本Takara公司；陶瓷研缽，河北鼎盛隆華實驗儀器有限公司；三氯甲烷、異丙醇和乙醇，天津風船試劑有限公司；EP管和槍頭，美國Axygen公司；DEPC水，北京索萊寶公司；Nanodrop2000分光光度儀，美國Thermo公司；逆轉錄試劑盒，美國Fermentas公司；OneStep RT-PCR Kit試劑盒，德國QIAGEN公司；miR-25-3p、ZEB2和內參GAPDH引物，上海捷瑞生物工程有限公司；7500熒光定量PCR儀，美國ABI公司；DAB顯色試劑盒，丹麥DAKO公司；ZEB2一抗，美國proteintech公司。HeLa細胞，上海科學院細胞庫；細胞培養基、FBS和胰酶，美國Gibco公司；miR-25-3p mimic、ZEB2-wt(野生型)和ZEB2-質粒mut(突變型)，上海吉凱基因有限公司；MTS試劑，英國Abcam公司；Boyden小室，美國BD公司。

4 實時熒光定量PCR檢測miR-25-3p、ZEB2 mRNA的相對表達量 將凍存的上述患者手術組織標本放入研缽中研磨成組織粉末后，加入TRIzol?試劑將組織移至EP管中，加入三氯甲烷混勻，靜置后高速低溫離心30 min，吸取上層上清液移至新的EP管中，加入等體積的異丙醇混勻后高速低溫離心30 min，乙醇洗1次，加入DEPC水溶解RNA，經Nanodrop2000測得其濃度。按照Fermentas逆轉錄試劑盒，以85℃ 5 s，37℃15 min反應條件將RNA逆轉為cDNA。以cDNA為模板，按照OneStep RT-PCR Kit試劑盒以95℃30 s和40個60℃ 30 s，72℃ 30 s循環進行PCR反應。7500熒光定量PCR儀檢測各個樣品的循環閾值(threshold cycle，Ct)。以GAPDH基因為內參，用2-ΔΔCt法 計 算miR-25-3p、ZEB2 mRNA的相對表達量。引物序列，miR-25-3p引物F：5′-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′，R：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；ZEB2引物F：5′-CAAGAGGCGCAAACAAGCC-3′，R：5′-GGTTGGCAATACCGTCATCC-3′；內參GAPDH引物F：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，R：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

5 免 疫 組 化(immunohistochemical，IHC)檢測ZEB2蛋白的表達 石蠟包埋的4 μm切片在60℃下烘烤2 h，采用二甲苯脫蠟15 min，放置遞減的乙醇進行水化，放置枸櫞酸鈉修復液中高壓100℃煮3 min進行抗原修復。PBS洗3次，每次5 min，采用10%山羊血清孵育石蠟切片30 min進行非特異性抗原封閉，與ZEB2一抗4℃孵育過夜。PBS洗3次，每次5 min，與二抗孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，添加DAB顯色液進行顯色。顯微鏡下觀察顯色，出現棕色時，將切片浸入蒸餾水中終止反應。放置蘇木素中染色2 min，放置遞增的乙醇中脫水并固定。對染色結果進行評分：1)腫瘤組織中陽性腫瘤細胞的百分比：0(0)，1(1% ～ 10%)，2(11% ～ 50%)，3(51% ～70%)和4(71% ～ 100%)；2)染色強度：0(無)，1(弱)，2(中)，3(強)。染色分數為陽性腫瘤細胞的比例 × 染色強度(0 ～ 12)。＞6分為ZEB2高表達，≤6分為ZEB2低表達。

6 HeLa細胞培養與轉染 宮頸癌細胞HeLa復蘇后重懸至含有10% FBS的高糖培養基，放置細胞孵育箱中培養。每隔1 d更換1次培養基，48 h采用胰酶消化，進行細胞傳代。以1.5 × 105/孔的細胞密度接種至6孔板中，分為NC組、miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組，放置細胞培養箱中培養12 h后，進行細胞轉染。NC組轉染lip2000和NC mimic，miR-25-3p mimic組轉染lip2000和 miR-25-3p mimic，miR-25-3p + oe-ZEB2組轉染lip2000和miR-25-3p mimic、ZEB2過表達質粒，轉染48 h后進行后續的實驗研究。

7 miR-25-3p靶向調控ZEB2的檢測 Target Scan7.1軟件(http://www.targetscan.org)預測miR-25-3p與ZEB2的3’UTR區存在結合位點。HeLa細胞以4 000/孔的細胞密度鋪至96孔板中，培養24 h后，NC + ZEB2-wt組細胞轉染lip2000和NC mimic、ZEB2-wt質粒，miR-25-3p mimic + ZEB2-1-wt組細胞轉染lip2000和miR-25-3p mimic、ZEB2-wt質粒，NC + ZEB2-mut組細胞轉染lip2000和NC mimic、ZEB2-mut質粒，miR-25-3p mimic + ZEB2-mut組細胞轉染lip2000和miR-25-3p mimic、ZEB2-mut質粒，放置細胞培養箱中培養12 h后更換培養基。轉染48 h后采用雙熒光素酶報道基因檢測試劑檢測各組細胞熒光素酶活性。

8 MTS實驗檢測細胞增殖 收集NC組、miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組細胞，以1 500/孔的細胞密度接種至96孔板中，每組設置6個復孔，放置細胞孵育箱中培養12 h后，每孔加入20 μL MTS試劑，并在細胞孵育箱中繼續培養2 h后，采用全酶標儀檢測樣品在490 nm處的OD值(吸光度值)。

9 Boyden實驗檢測細胞侵襲 收集NC組、miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組細胞，無血清細胞洗3次后，以1.5 × 105/孔的細胞密度接種至96孔板中，每組設置6個復孔，放置細胞孵育箱中培養0 h、24 h、48 h和72 h后，每孔分別加入20 μL MTS試劑，并在細胞孵育箱中繼續培養2 h后，采用全酶標儀檢測樣品在490 nm處的OD值(吸光度值)。

10 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量數據以±s表示，采用獨立樣本t檢驗比較兩組間的差異；多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Kaplan-Meier生存曲線及log-rank檢驗，分析miR-25-3p和ZEB2的表達水平對宮頸癌患者預后的影響。Pearson線性相關分析宮頸癌組織中miR-25-3p與ZEB2表達的相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 研究對象一般情況 患者的平均年齡為(57.38±10.98)歲，≤55歲33例，＞55歲51例；組織類型：鱗癌60例，腺癌24例；組織學分級：低級39例，中高級45例；腫瘤直徑：≤4 cm 50例，＞4 cm 34例；淋巴結轉移：有淋巴結轉移40例，無淋巴結轉移44例；肌層浸潤深度：淺肌層55例，深肌層29例；脈管癌栓：有脈管癌栓21例，無脈管癌栓63例；FIGO分期：Ⅰ ～Ⅱ期40例，Ⅲ ～ Ⅳ期44例。對照組平均年齡為(56.58±12.06)歲，≤55歲16例，＞55歲24例。

2 宮頸癌組織中miR-25-3p、ZEB2表達水平與患者臨床病理參數之間的關系 miR-25-3p在宮頸癌組織中的表達水平與患者的年齡、組織類型、組織學分級、腫瘤直徑和脈管癌栓均無關(P＞0.05)，與淋巴結轉移、肌層浸潤深度和FIGO分期相關(P＜0.05)。ZEB2 mRNA及蛋白在宮頸癌組織中的表達水平與患者的年齡、組織類型、腫瘤直徑、肌層浸潤深度和脈管癌栓均無關(P＞0.05)，與組織學分級、淋巴結轉移和FIGO分期相關(P＜0.05)。見表1。

表1 miR-25-3p和ZEB2在宮頸癌組織中的表達水平與臨床病理參數之間的關系Tab. 1 Relationship between expression levels of miR-25-3p and ZEB2 in cervical cancer and clinicopathological parameters

3 宮頸癌組織中miR-25-3p、ZEB2表達水平對患者預后的影響 84例宮頸癌患者中死亡55例，存活29例，5年總生存(overall survival，OS)率為34.52%。miR-25-3p高表達組的5年OS率為43.59%，miR-25-3p低表達組的5年OS率為26.67%，低表達組預后較差(P＜0.05)。ZEB2mRNA高表達組5年OS率為25.58%，ZEB2 mRNA低表達組5年OS率為43.90%，高表達組預后較差(P＜0.05)。ZEB2蛋白高表達組5年OS率與mRNA組趨勢一致。見表2，圖1。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線分析miR-25-3p和ZEB2表達對宮頸癌患者預后的影響Fig.1 Kaplan-Meier survival curve analysis of the effect of miR-25-3p and ZEB2 expression on the prognosis of cervical cancer patients

表2 不同miR-25-3p、ZEB2 mRNA、ZEB2蛋白表達水平宮頸癌患者生存比較(n, %)Tab. 2 Comparison of survival of cervical cancer patients with different levels of miR-25-3p, ZEB2 mRNA and ZEB2 protein expression (n, %)

4 qRT-PCR檢測miR-25-3p、ZEB2 mRNA在宮頸癌組織中的表達水平 qRT-PCR檢測84例宮頸癌組織和40例宮頸正常對照組織中miR-25-3p、ZEB2 mRNA的表達水平。結果顯示，miR-25-3p在宮頸癌組織中的表達(0.70±0.22)顯著低于其在宮頸正常對照組織中的表達(1.00±0.26)，差異有統計學意義(t=6.687，P=0.000)。ZEB2 mRNA在宮頸癌組織中的表達(1.33±0.43)顯著高于其在宮頸正常對照組織中的表達(1.00±0.31)，差異有統計學意義(t=4.864，P=0.000)。

5 IHC檢測ZEB2蛋白在宮頸癌組織中的表達水平 IHC檢測84例宮頸癌組織和40例宮頸正常對照組織中ZEB2蛋白的表達水平。結果顯示，ZEB2 蛋白在宮頸癌組織中高表達率為57.14%(48/84)，顯著高于其在宮頸正常對照組織中的高表達率32.50%(13/40)，差異有統計學意義(χ2=6.584，P=0.010)。見圖2。

圖2 IHC檢測ZEB2蛋白的表達(200×)Fig.2 Expression level of ZEB2 protein detected by IHC (200×)

6 miR-25-3p與ZEB2 mRNA、ZEB2蛋白在宮頸癌組織中表達的相關性 Pearson相關分析顯示，miR-25-3p與ZEB2 mRNA、ZEB2蛋白在宮頸癌組織中的表達呈負相關(r=-0.671，P=0.000；r=-0.592，P=0.000)。見圖3。

圖3 宮頸癌組織中miR-25-3p和ZEB2相對表達的相關數據散點圖(n=84)Fig.3 Scatter diagram of relative expression of miR-25-3p and ZEB2 in cervical cancer (n=84)

7 miR-25-3p對ZEB2的靶向調控作用 Target Scan7.1軟件在線預測顯示ZEB2的3’UTR區與miR-25-3p具有結合位點。雙熒光素酶報道基因試驗結果顯示，與NC + ZEB2-wt共轉染組相比，miR-25-3p + ZEB2-wt共轉染組的熒光素酶活性降低(P＜0.05)，而NC + ZEB2-mut和miR-25-3p +ZEB2-mut組間的熒光素酶活性無統計學差異(P＞0.05)。見表3。

表3 各組熒光素酶活性Tab. 3 Luciferase activity in each group

8 qRT-PCR檢測miR-25-3p mimic和ZEB2過表達質粒轉染效果 qRT-PCR檢測結果顯示，NC組和miR-25-3p mimic組細胞中miR-25-3p的表達分別為1.03±0.04和6.54±1.29，與NC組相比，miR-25-3p mimic組細胞中miR-25-3p表達顯著增加(t=7.395，P=0.002)，miR-25-3p mimic成功轉染宮頸癌HeLa細胞。NC組、miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組細胞中ZEB2的表達分別為1.04±0.03、0.52±0.14和0.73±0.08，與NC組相比，miR-25-3p mimic組細胞中ZEB2的表達顯著降低(LDS-t=6.726，P=0.001)，表明miR-25-3p負調控ZEB2的表達。與miR-25-3p mimic組相比，miR-25-3p + oe-ZEB2組細胞中ZEB2的表達顯著增加(LDS-t=2.716，P=0.035)，表明ZEB2過表達質粒成功轉染宮頸癌HeLa細胞。見圖4。

圖4 miR-25-3p與ZEB2啟動子區結合位點Fig.4 Binding sites of miR-25-3p and ZEB2 promoter region

9 MTS檢測miR-25-3p靶向ZEB2對宮頸癌細胞增殖能力的影響 MTS實驗結果顯示，與NC組相比，miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組細胞增殖能力顯著降低(P＜0.05)；與miR-25-3p mimic組相比，miR-25-3p + oe-ZEB2組細胞增殖能力顯著增加(P＜0.05)。見圖5。

圖5 MTS實驗檢測miR-25-3p靶向ZEB2對宮頸癌細胞增殖能力的影響 (aP＜0.05，vs NC組；bP＜0.05， vs miR-25-3p mimic組)Fig.5 Effect of miR-25-3p targeted ZEB2 on the proliferation of cervical cancer cells detected by MTS test (aP＜0.05, vs NC group; bP＜0.05, vs miR-25-3p mimic group)

10 Boyden實驗檢測miR-25-3p靶向ZEB2對宮頸癌細胞侵襲能力的影響 Boyden實驗結果顯示，與NC組相比，miR-25-3p mimic組和miR-25-3p+oe-ZEB2組細胞侵襲能力顯著降低(P＜0.05)；與miR-25-3p mimic組相比，miR-25-3p+oe-ZEB2組細胞侵襲能力顯著增加(P＜0.05)。見圖6、圖7。

圖6 Boyden實驗檢測miR-25-3p靶向ZEB2對宮頸癌細胞侵襲能力的影響 (aP＜0.05，vs NC組；bP＜0.05，vs miR-25-3p mimic組)Fig.6 Effect of miR-25-3p targeted ZEB2 on the invasive ability of cervical cancer cells detected by Boyden test (aP＜0.05, vs NC group; bP＜0.05, vs miR-25-3p mimic group)

圖7 Boyden實驗檢測宮頸癌細胞侵襲能力Fig.7 The invasive ability of cervical cancer cells detected by Boyden test

討 論

miRNA屬于一類小的內源性非編碼RNA，長度為21 ～ 24個核苷酸，其在一系列腫瘤惡性生物學過程中發揮重要作用，包括腫瘤增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲[11-12]。miR-25-3p是位于染色體7q22.1上MCM7癌基因的內含子13的簇成員，其表達失調可導致包括惡性腫瘤在內的多種疾病的發生發展[13]。研究報道miR-25-3p依據不同的腫瘤類型可發揮癌因子和抑癌因子。miR-25-3p的過表達顯著促進子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[4]。miR-25-3p上調促進了骨肉瘤細胞的生長、侵襲和耐藥性，并且骨肉瘤組織中miR-25-3p的高表達與患者臨床預后呈負相關[14]。而盧沐[6]報道miR-25-3p抑制食管癌細胞增殖和侵襲能力。已有研究報道在宮頸癌順鉑耐藥細胞中miR-25-3p表達降低，miR-25-3p的異位表達逆轉了EMT表型并促使宮頸癌細胞對順鉑敏感度增加[7]。而miR-25-3p在宮頸癌組織中的表達及作用未知，本文采用qRT-PCR檢測發現miR-25-3p在84例宮頸癌組織中的表達顯著低于在40例宮頸對照組織中的表達水平，并且miR-25-3p的表達水平與宮頸癌患者淋巴結轉移、肌層浸潤深度和FIGO分期顯著相關。表明miR-25-3p表達降低參與宮頸癌的發生發展。此外，生存分析顯示miR-25-3p低表達的宮頸癌患者預后較差，提示miR-25-3p可能是宮頸癌患者預后標志物。

在既往研究中，miR-25-3p在腫瘤中通過靶向BTG2和NOTCH1等基因發揮作用[4-6]。通過與靶基因的啟動子區結合而負調控靶基因的表達是miRNA發揮生物學功能的作用機制[10]。Target Scan7.1生物學信息軟件預測及雙熒光素酶報告基因結果顯示ZEB2基因是miR-25-3p的直接靶基因。本文采用qRT-PCR檢測發現ZEB2 mRNA和蛋白在84例宮頸癌組織中的表達顯著高于在40例宮頸對照組織中的表達水平，并且ZEB2 mRNA和蛋白與miR-25-3p在宮頸癌組織中的表達呈負相關。ZEB2是由位于人的染色體2上Zfhx1 B基因編碼的蛋白質分子，其中間結構是可變區，每側有兩個獨立且高度保守的鋅指簇[15]。ZEB2最重要的功能是參與EMT，即誘導腫瘤細胞轉化為具有高侵襲性和遷移能力的間充質表型，從而導致間充質標志物(N-鈣黏著蛋白和波形蛋白)的獲得以及上皮標記物(E-鈣黏著蛋白)的丟失[16]。Ye等[9]研究發現ZEB2在宮頸癌組織中過表達，與我們的研究一致，并且他們研究發現ZEB2在宮頸癌組織中與miR-377的表達水平呈負相關，是miR-377的靶基因。同時本文分析發現ZEB2 mRNA和蛋白表達水平與宮頸癌的組織學分級、淋巴結轉移和FIGO分期相關。本文采用生存分析顯示ZEB2 mRNA和蛋白高表達的宮頸癌患者預后較差，提示ZEB2可能是宮頸癌患者預后標志物。miR-25-3p是否通過負調控其靶基因ZEB2參與宮頸癌的惡性進展，本文在細胞水平進行了功能學實驗，結果顯示miR-25-3p顯著抑制了宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力，但ZEB2可以逆轉miR-25-3p在宮頸癌中發揮的抑癌作用，因此miR-25-3p是通過負調控ZEB2抑制宮頸癌細胞的惡性進展。

綜上所述，miR-25-3p在宮頸癌組織中低表達，ZEB2 mRNA和蛋白在宮頸癌組織中高表達，兩者的表達水平在宮頸癌中呈負相關，miR-25-3p是靶向負調控ZEB2抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力，miR-25-3p和ZEB2可能是治療宮頸癌的潛在靶點和預后標志物。