丙酮酸脫氫酶E1亞基α1在腎透明細胞癌中的表達及影響

宋松澤，齊 琳，張德宇，石煙祝，張菲婭，沈雁婕，葉棋濃，藺 靜

1 錦州醫科大學研究生培養基地(解放軍總醫院第四醫學中心)，北京 100048；2 解放軍總醫院第四醫學中心 檢驗科，北京 100048；3 錦州醫科大學，遼寧錦州 121001；4 軍事科學院軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100850

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是人體腎癌中最常見的病理亞型，其發生率逐漸增高，尋找早期診斷和預測預后的重要生物標志物，對ccRCC的治療和預后判斷有重大意義。現已明確，ccRCC是一種代謝性疾病，通常伴隨著葡萄糖代謝和三羧酸循環的重編程[1-2]。因此，探索糖代謝相關的重要基因和蛋白表達水平的變化，對于揭示ccRCC的發生發展具有重要意義。

連接糖酵解和三羧酸循環的丙酮酸脫氫酶復合物(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)位于真核細胞線粒體基質中，包括丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)、二氫硫辛酰胺乙酰轉移酶(dihydrolipoamide acetyltransferase，DLAT)和脂肪酰胺脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD)[3]。PDHC活性缺失與部分代謝紊亂疾病相關，如肌無力、乳酸中毒及神經系統退行性疾病等[4-5]。丙酮酸脫氫酶E 1亞基α 1(pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，PDHA1)作為PDHC催化反應的起始酶，是決定丙酮酸進入三羧酸循環或糖酵解代謝途徑的關鍵調節因子之一。近年研究發現，PDHA1的表達水平降低可能與部分癌癥的發生有關，如乳腺癌、胃癌、食管癌等[6-8]。然而，PDHA1是否能調節ccRCC生長和影響腫瘤預后尚不清楚。本研究通過生物信息學分析及體外細胞實驗探索PDHA1在ccRCC中的表達及其生物學功能，為進一步研究PDHA1抑制ccRCC的分子機制奠定基礎。

材料與方法

1 實驗細胞系 人ccRCC 786-O細胞系(中國科學院上海細胞研究所)。

2 主要試劑 胎牛血清、RPMI 1640培養基(美國Gibco公司)和PBS緩沖液；細胞培養板及一次性無菌10 mL移液管(無錫耐思生物科技有限公司)；pcDNA3.0-Flag-PDHA1表達載體由本室構建；質粒提取試劑盒和CCK-8試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；4%多聚甲醛(廣州賽國生物科技有限公司)；抗Flag抗體(英國Abcam公司)。

3 數據資料采集 登錄癌癥基因組圖譜網站(the cancer genome atlas，TCGA；https://cancergenome.nih.gov)，在數據庫中下載ccRCC數據集的臨床資料及RNASEqV2信息。

4 ccRCC的表達分析和生存分析 從UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)調取TCGA數據庫，分析PDHA1在ccRCC中的表達，并比較PDHA1高表達與低表達患者的無病生存期(disease free survival，DFS)和總生存期(overall survival，OS)差異。

5 基于PDHA1表達量的基因差異分析 采用R軟件的“DESeq2”程序包輔助編程，對高、低表達PDHA1的ccRCC RNA-seq數據進行分析，查找差異基因，對差異基因行基因本體(gene ontology，GO)注釋、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析。

6 細胞轉染與Western blot檢測 ccRCC 786-O細胞以65% ～ 75%的密度均勻接種于2個6 cm皿中，同時加入4 mL含1%雙抗及10%胎牛血清的RPMI 1640培養基。將5 μL Lipofectamine 2000與195 μL NaCl溶液混勻，靜置5 min。隨后將10 μg的Flag-PDHA1與NaCl混勻，使其總量為200 μL。再將上述兩種混合液混勻共計400 μL，室溫靜置15 min，加入6 cm培養皿中。同樣方法轉染Flag空載體作為對照。6 h后換液，24 h后棄去細胞培養基，將細胞收集于EP管中，離心棄去上清，加入細胞體積3倍的RIPA，冰浴30 min，再加與RIPA等量的SDS，沸水浴10 ～ 15 min，離心后取上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。以半干轉的方式轉膜，16 V，50 min。用含1 g脫脂奶粉的20 mL TBST封閉液封閉1 h，HRP-Flag抗體孵育1 ～ 2 h，TBST洗膜4次后，化學發光法顯色，壓片4 min，顯影。

7 CCK-8法檢測PDHA1對786-O細胞生長的影響 將Flag-PDHA1及Flag空載體分別轉染于786-O細胞，常規培養24 h后，胰酶消化3 ～5 min，用細胞培養基重懸細胞，于96孔板每孔接種200 μL細胞懸液(細胞密度3 000/孔)，過表達Flag-PDHA1組和Flag空載體均設3個復孔。待細胞貼壁后，吸去培養基，每孔加入100 μL稀釋后CCK-8反應液(CCK-8與培養基按1∶10進行稀釋)。37℃下繼續培養1 h后測量第0、1、2、3、4天450 nm波長下光密度(optical density，OD)值。

8 克隆形成實驗 將轉染后的786-O細胞，以2 000個/孔的密度接種于6孔板中，過表達Flag-PDHA1組和Flag空載體組均設3個復孔。培養14 d后，棄去培養基，PBS清洗后，使用4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色，計數克隆數。

9 劃痕實驗 將786-O細胞按70%左右的密度均勻接種6孔板，分別轉染Flag-PDHA1及Flag空載體，每組設3個復孔。待細胞密度接近100%時，用高壓滅菌槍頭，垂直于細胞平面并勻速劃過細胞，PBS沖洗，鏡下隨機拍取3個位置，并做好標記。常規培養24 h后，在標記處拍照記錄，計算細胞相對遷移距離。

10 統計學方法 通過SPSS25.0和GraphPad Prism 8軟件對實驗數據進行統計分析。采用Mann-WhitneyU方法分析臨床資料組間PDHA1基因表達的差異，采用Kaplan-Meier繪制生存曲線。細胞實驗中，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PDHA1在腎癌患者中表達情況分析 本研究從TCGA數據庫中下載533例ccRCC組織以及72例癌旁正常組織的RNA-seq數據。分析發現，ccRCC組織中PDHA1 mRNA表達明顯低于癌旁組織(P＜0.01)。Ⅲ期ccRCC患者腫瘤組織中PDHA1 mRNA水平低于Ⅰ期患者(P＜0.01)。腫瘤分級為Ⅱ級和Ⅲ級的患者，腫瘤組織中PDHA1 mRNA水平明顯高于Ⅳ級患者(P＜0.01)。淋巴結是否轉移與PDHA1 mRNA水平無關(P＞0.05；圖1)。

圖1 ccRCC組織中PDHA1表達水平 A：癌旁組織和ccRCC組織中表達差異；B：不同病理分期樣本中表達差異；C：不同分級樣本中表達差異；D：淋巴結未轉移和轉移的樣本中表達差異Fig.1 PDHA1 expression levels in ccRCC A: Expression difference between adjacent tissues and ccRCC tissues; B: Expression levels in tissues of different cancer stages; C: Expression levels in tissues of different tumor grades; D: Expression levels in tissues with or without lymph node metastasis

以PDHA1表達水平的中位數為切點，將ccRCC患者分為PDHA1高表達組(258例)及PDHA1低表達組(258例)。生存曲線結果表明，高表達組患者無病生存期和總生存期更長(P＜0.01；圖2)。

圖2 ccRCC組織中PDHA1表達水平與臨床預后的關系A：無病生存期；B：總生存期Fig.2 Relationship between PDHA1 expression level and clinical prognosis in ccRCC A: DFS; B: OS

2 PDHA1高表達和低表達組間差異基因分析以中位數為分界點，將ccRCC患者分為高表達組和低表達組，進行組間差異基因分析，篩選出705個差異基因，較PDHA1低表達組，PDHA1高表達組上調577個基因，下調128個基因(圖3)。為了解兩組差異基因的功能，對705個差異基因進行GO及KEGG分析。將GO注釋和KEGG通路分析的前15個結果繪制圖形，GO及KEGG分析結果均顯示，PDHA1調控ccRCC可能與凝血通路有關(圖4)。

圖3 PDHA1高表達與PDHA1低表達組間差異表達基因Fig.3 Differential expression genes between groups with high expression of PDHA1 and low expression of PDHA1

圖4 PDHA1高表達與PDHA1低表達組間差異基因的GO注釋(A)和KEGG通路(B)分析Fig.4 GO (A) and KEGG (B) pathway anotation between groups with high expression of PDHA1 and low expression of PDHA1

3 CCK-8實驗 Western blot實驗顯示，Flag-PDHA1轉染的786-O細胞成功表達PDHA1蛋白(圖5A)。另外，通過CCK-8方法觀察786-O細胞在第0、1、2、3、4天的生長情況，相比于空載體組，轉染Flag-PDHA1后，786-O細胞在第4天生長明顯受到抑制(P＜0.01；圖5B)。

圖5 PDHA1抑制786-O細胞增殖 A：Western blot；B：細胞生長曲線 (P＜0.01, vs Flag-PDHA1)Fig.5 PDHA1 inhibited proliferation of 786-O cells A: Western blot; B: Cell growth curves (P＜0.01, vs Flag-PDHA1)

4 克隆形成實驗 為了從多方面驗證PDHA1抑制786-O細胞生長，在786-O細胞中分別轉染Flag-PDHA1和Flag空載體，以2 000/孔的細胞密度鋪于6孔板。結果表明，轉染Flag-PDHA1組的786-O細胞克隆數量顯著低于空載體組，再次說明PDHA1抑制786-O細胞增殖(P＜0.01；圖6)。

圖6 PDHA1抑制786-O細胞增殖A：克隆形成實驗；B：克隆數量Fig.6 PDHA1 inhibited the proliferation of 786-O cellsA: Colony formation assay; B: Colony number

5 細胞劃痕實驗 將Flag-PDHA1和Flag空載體分別轉染786-O細胞后，劃痕實驗顯示，與空載體組相比，Flag-PDHA1可明顯抑制786-O細胞的遷移能力(P＜0.01；圖7)。

圖7 PDHA1抑制786-O細胞遷移A：劃痕實驗；B：相對細胞遷移Fig.7 PDHA1 inhibited the migration of 786-O cellsA: Wound healing assay; B: Relative cell migration

討 論

糖代謝是生物體三大能量代謝之一，PDHA1作為連接糖酵解和三羧酸循環的平衡樞紐而被廣泛關注。由于ccRCC通常伴隨著葡萄糖代謝和三羧酸循環的重編程[1-2]，因此我們對PDHA1在ccRCC中的表達及影響進行了探討。

我們通過檢索TCGA數據庫發現，PDHA1在ccRCC組織中表達明顯低于癌旁組織，PDHA1的表達與ccRCC分期和分級相關，并且與腎癌患者無病生存期和總生存期呈正相關。另外，體外細胞實驗顯示，786-O細胞高表達PDHA1后，細胞增殖、克隆形成和遷移能力均明顯減弱。因此，PDHA1的表達水平降低可能與ccRCC的發生發展有關。與之相似，PDHA1的表達水平降低與乳腺癌、胃癌、食管癌等腫瘤的發生發展和預后也密切相關[6-10]。乳腺癌中，乙型肝炎X相互作用蛋白(hepatitis B X-interacting protein，HBXIP)通過穩定缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)提高miR-96的表達，miR-96在轉錄水平抑制PDHA1的表達，增強葡萄糖代謝重編程，從而促進乳腺癌細胞的生長[11]。PDHA1 mRNA高表達乳腺癌患者總生存期明顯高于低表達者[6]。胃癌中，細胞實驗顯示PDHA1低表達能促進糖酵解，并導致胃癌細胞增殖、克隆形成和侵襲[7]。胃癌組織中PDHA1表達也顯著下調，與預后不良相關[9]。食管癌的研究顯示，食管癌細胞中PDHA1基因被敲除后，導致細胞產生代謝重編程，出現Warburg效應以及細胞惡性程度增加[8]。PDHA1蛋白低表達與食管癌預后不良有關[10]。另外，在腎癌組織中，己糖激酶Ⅱ(hexokinase Ⅱ，HKⅡ)可增加PDHA1上Ser293位點磷酸化，PDHC活性降低，從而改變代謝途徑，促進了Warburg效應[12]。

以上研究提示，PDHA1通過調控糖代謝抑制腫瘤細胞生長。除了調控糖代謝，PDHA1發揮作用也與其他機制有關。Chen等[13]報道頭頸鱗狀細胞癌中，PDHA1敲低表達后通過激活絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，Akt)和細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路促進細胞生長。另外，敲低PDHA1基因，可誘導肺癌細胞發生上皮間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)，進而導致肺癌細胞對順鉑產生耐藥[14]。Sun等[15]發現高表達PDHA1可激活促凋亡BCL2關聯X蛋白(bcl-2 associated X protein，Bax)信號通路，調節下游蛋白半胱天冬酶3/9，進而誘導肝癌細胞凋亡。

為了進一步探討PDHA1低表達促進ccRCC細胞生長的機制，我們對PDHA1高表達后的705個差異基因進行了GO注釋和KEGG富集分析，兩者均顯示PDHA1與凝血通路有關。多個研究顯示，止血因子和腫瘤的生物特征在多方面都存在相互聯系，腫瘤細胞能激活凝血系統，凝血因子參與腫瘤進展，凝血級聯反應還可能特異性調節抗腫瘤免疫，凝血通路中相關分子有望成為新的抗腫瘤藥物靶標[16-18]。因此，PDHA1可能通過凝血通路相關分子影響腫瘤進展。GO 注釋及KEGG富集分析為深入研究PDHA1在ccRCC發生發展中的機制提供了方向。