國慶1號溫州蜜柑珠心胚苗培育及四倍體發掘

關鍵詞：柑橘；珠心胚；四倍體；流式細胞術；SSR分子標記

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）02-0309-07

溫州蜜柑為細胞質雄性不育類型[1]，果實無核，易剝皮，品質佳，易栽培，是中國很多柑橘產區重要的主栽品種。國慶1 號溫州蜜柑是華中農業大學早期從龜井溫州蜜柑芽變選出的早熟品種。在生產中，為保持品種特性，柑橘一般采用無性繁殖，但長期無性繁殖會在其體內積累一種或多種病毒、類病毒及細菌性病害[2]，導致出現一定程度的品種退化，逐漸表現出生活力降低、產量下降和品質衰退等現象，急需進行提純復壯和品種改良。由于大多數病毒病不能通過種子傳播，柑橘珠心胚苗能脫除大多數病毒，通常表現為生長勢比親本更旺盛，從而達到提純復壯的目的[3-4]。

基于珠心系實生變異選擇育種是柑橘的重要育種途徑。日本育種家利用珠心系變異選育出大批熟期、果型、果皮色澤各異的溫州蜜柑新品種，如興津早生、三保早生等品種就是利用溫州蜜柑的多胚性，從宮川溫州蜜柑珠心系選育而來[3，5]。黃秀等[6]以由良溫州蜜柑為母本與雞尾葡萄柚等4 個品種有性雜交，獲得溫州蜜柑種子用于珠心苗培育，以期選育符合市場需求的新品種。筆者在本研究中以國慶1 號溫州蜜柑為材料，采用離體播種方法培育珠心胚苗，以期為國慶1 號溫州蜜柑提純復壯、珠心胚變異發掘和相關基礎研究提供珍貴的種質材料。

1 材料和方法

1.1 研究材料

國慶1 號溫州蜜柑（Citrus unshiu Marc.，簡稱G1）嫁接于枳砧并定植于華中農業大學柑橘育種試驗基地，其周圍栽植有華農本地早橘等品種，樹齡均10 a（年）以上。2021 年1 月因低溫凍害影響，國慶1號溫州蜜柑果實受凍而不可食用，全部采摘用于收集種子。

1.2 種子離體培養

將飽滿種子置于1 mol?L^{- 1} NaOH 溶液中浸泡15 min 去除果膠，用自來水沖洗干凈后剝去外種皮；無菌條件下，將去除外種皮的種子置于3%（φ）NaClO 溶液中浸泡消毒15 min；用無菌蒸餾水清洗至少3 次后，將種子轉移至滅菌的三角瓶；用鑷子去除內種皮后，將其接種于播種培養基（MT + 25 g·L-1蔗糖，pH = 5.8）并置于培養室光照培養。培養室條件：溫度（25±1）℃；光照16 h。

1.3 倍性鑒定

待幼苗長至有3～5 枚真葉大小時，用流式細胞儀和根尖染色體壓片2 種方法檢測植株倍性。流式細胞儀（Cyflow space，Sysmex，Japan）倍性檢測參考解凱東等[7]的方法。根尖染色體壓片參考夏強明[8]的方法并適當修改。取生長旺盛的根尖，飽和對二氯苯溶液室溫下預處理3 h 后，用新鮮的卡諾固定液（V _乙醇∶V _乙酸= 3∶1）固定24 h，最后轉移至75%乙醇溶液4 ℃保存備用。制片前，根尖用酶液（1%果膠酶（Sigma- aldrich）、2%纖維素酶Onozuka（R- 10，Yakult）和1%果膠酶（Y-23，Yakult））37 ℃水浴處理90 min 后，用火焰干燥法進行染色體制片，并用熒光顯微鏡（Imager. M2，Zeiss，Germany）鏡檢，染色體圖像用ZEN軟件采集。

四倍體群體發生頻率/%=四倍體植株數/群體植株總數×100。

1.4 植株移栽

將倍性分析后的所有植株移栽至裝有營養土（V _{進口泥炭土}∶V _基質土∶V _蛭石∶V _珍珠巖= 4∶4∶1∶1）的營養缽并置于生長室煉苗。待幼苗長至7～8 枚真葉大小時，將其轉移至溫室，期間保證正常肥水管理。生長室條件：溫度（25±1）℃；光照16 h。

1.5 SSR分子鑒定

基因組DNA 提取和SSR 分子標記分別參考Cheng 等[9]和謝善鵬等[10]的方法。篩選的4 對多態性SSR 引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系10 μL：2× PCR mix 5 μL，正、反向引物各0.25 μL（10 μmol?L-1），DNA 模板1 μL，無菌水3.5 μL。PCR 反應在ProFlex PCR 儀（ABI，USA）進行，擴增程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，35 個循環，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產物由全自動毛細管電泳系統（QIAxcel Advanced，QIAGEN）電泳分離。

2 結果與分析

2.1 離體實生播種獲得62株國慶1號溫州蜜柑幼苗

溫州蜜柑一般表現為雄性不育、果實無核，種子極少見；但若花期遇高溫，育性能部分恢復，成熟果實可能偶爾有少量種子。基于該現象，筆者從國慶1 號溫州蜜柑約12 500 個成熟果實中，剝取獲得106 粒種子（圖1-A），其中80 粒為飽籽，26 粒為癟籽（圖1-B）。對所有種子離體播種培養，由于部分飽滿種子污染和癟籽未能萌發，最終有41 粒飽滿種子萌發，萌發率為38.7%；經培養獲得再生實生幼苗62 株，平均每粒種子再生植株1.5 株（圖1-C～D）。

2.2 倍性分析發掘1株國慶1號溫州蜜柑四倍體植株

用流式細胞儀對所有62 株實生幼苗進行倍性分析，其中61 株為二倍體（圖2-A），發掘獲得1 株四倍體植株（圖2-B），四倍體發生頻率1.61%。進一步用根尖壓片法對獲得的四倍體進行染色體數目分析，表明其染色體數為36 條（圖2-D），是二倍體（圖2-C）染色體數目的2 倍，驗證了流式細胞儀倍性分析結果的可靠性。

2.3 SSR分子鑒定

將倍性分析后的所有實生幼苗移栽至溫室。當幼苗長至一定大小后，選取4 對擴增效果好的多態性SSR分子標記對隨機選取的38 株二倍體植株和1株四倍體植株進行遺傳鑒定（圖3）。結果表明，四倍體植株帶型與其親本國慶1 號溫州蜜柑完全一致（圖3-T4），表明該四倍體可能由國慶1 號溫州蜜柑珠心細胞自然加倍形成，為雙二倍體；而38 株二倍體植株中，35 株的條帶與國慶1 號溫州蜜柑完全一致，推測由國慶1 號溫州蜜柑珠心胚發育而來；其余3 株二倍體植株（I1、O2、S3）與國慶1 號溫州蜜柑條帶不一致，為合子胚來源，可能為國慶1 號溫州蜜柑與其附近其他柑橘品種的天然有性后代。

3 討論

筆者在本研究中采用成熟種子離體播種，結合倍性分析和SSR 分子鑒定，發掘出1 株國慶1 號溫州蜜柑四倍體植株；隨機挑選的38 株二倍體實生幼苗，3 株為國慶1 號溫州蜜柑有性胚苗，其余35 株為珠心胚苗。這些種質材料將助力國慶1 號溫州蜜柑提純復壯、珠心胚變異育種及相關基礎研究。

溫州蜜柑一般表現為雄性不育、果實無核；但若對其授粉或花期遇高溫（育性會部分恢復），其果實偶爾會產生種子。如黃秀等[6]發現自然條件下，由良溫州蜜柑果實基本無核，而用其他品種的花粉對其人工授粉，可獲得少量種子（單果種子數介于0.36～1.66 粒之間）；鄧秀新等[14]對移入25 ℃溫室的國慶1 號溫州蜜柑花粉育性進行統計，與對照相比表現出育性恢復現象，筆者在本研究中從約12 500個國慶1 號溫州蜜柑成熟果實獲得106 粒種子的結果與前人研究基本一致。推測國慶1 號溫州蜜柑種子可能由其與周圍栽植的華農本地早橘等其他品種異花授粉形成或由于其花粉育性部分恢復后自交形成。筆者在本研究中離體播種了80 粒飽籽和26 粒癟籽，由于操作不當，部分飽籽污染，僅41 粒飽籽萌發；而癟籽均未萌發，可能與癟籽營養不足或低溫受凍導致種子活力下降等有關。

筆者采用4 對SSR 引物對發掘的1 株四倍體和38 株二倍體實生幼苗進行遺傳鑒定，發現四倍體帶型與其二倍體親本完全一致，與前人研究一致[15-17]，推測其由國慶1 號溫州蜜柑珠心細胞自然加倍形成。王江波等[18]用ISSR 分子標記對由種子萌發來的7 株蘆柑實生苗進行遺傳鑒定，其與母本條帶完全一致均為珠心苗。筆者在本研究中隨機挑選的38 株二倍體植株中，35 株二倍體植株條帶與母本完全一致，為珠心胚苗；其余3 株二倍體植株遺傳背景與國慶1 號溫州蜜柑不一致，推測其為國慶1 號溫州蜜柑與周圍其他柑橘品種異花授粉形成的有性胚苗。日本科學家最近報道宮川溫州蜜柑四倍體與二倍體正反雜交時，均能產生飽滿種子和三倍體后代，說明宮川溫州蜜柑四倍體育性恢復，可以用作育種親本[17]。筆者在本研究中發掘的國慶1 號溫州蜜柑四倍體，其開花結果習性有待觀察評價，國慶1 號溫州蜜柑四倍體為細胞質雄性不育等相關基礎研究和多倍體育種提供了珍貴的種質材料；培育的國慶1號溫州蜜柑珠心胚苗將有助于該品種提純復壯和二倍體水平珠心苗變異發掘。