真菌熒光染色在侵襲性真菌病中的應用價值

張澍雅 陳眾博 虞亦鳴 莊起東 於學嬋 陳輝 李安琪鄧在春 鄭琳

1.寧波大學醫學院附屬醫院呼吸與危重癥科，浙江寧波 315000；2.寧波大學醫學院附屬醫院微生物室，浙江寧波 315000

近年來，侵襲性肺部真菌感染（invasive pulmonary fungal infection，IPFI）的發病率明顯上升，免疫力低下的患者發病率更高[1,2]。同時IPFI 也日漸成為器官移植受者、惡性血液病和惡性腫瘤患者以及其他危重病患者的死亡原因之一[3,6]。IPFI 是由真菌直接侵犯(非寄生、過敏或毒素中毒)肺或支氣管引起的急、慢性組織病理損害所導致的，及早診斷、及時治療對提升疾病治愈率、降低死亡率相當重要。目前主要診斷方法包括微生物學檢查（真菌直接鏡檢、真菌培養和鑒定、真菌血清學檢查、分子生物學方法）和組織病理學檢查，其中真菌直接鏡檢操作簡便，可快速報告結果，具有重要的臨床價值[7]。真菌免疫熒光染色是近年來新發展的一項直接鏡檢方法。既往研究表明真菌免疫熒光染色在淺表真菌感染診斷中具有重要臨床價值[8-11]，但關于其在侵襲性真菌病診斷中的應用價值研究不多。本研究以IPFI為例，通過對高度懷疑IPFI 患者的肺泡灌洗液以及血液的檢查結果進行收集、分析統計，評估真菌熒光染色在侵襲性真菌病中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018 年1 月至2021 年12 月寧波大學醫學院附屬醫院呼吸與危重癥科收治的高度懷疑侵襲性肺部真菌感染的住院患者資料170 例，其中66 例患者懷疑曲霉菌感染，76 例患者懷疑隱球菌感染，28 例患者考慮其他真菌感染。納入標準：①具有IPFI 高危因素、臨床表現、影像學特征；②住院期間完成支氣管鏡檢查，并采取肺泡灌洗液；③病例資料完整；④年齡≥18 歲。排除標準：①明確為細菌、真菌感染；②妊娠期、哺乳期；③靜脈滴注白蛋白或免疫球蛋白者；④存在其他可能影響實驗結果的因素。研究共收集患者資料170份，本研究征得患者知情同意，并經寧波大學醫學院附屬醫院倫理委員會批準實施（倫理學審批號：KS20224012）。

1.2 標本采集

所有患者肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）均為支氣管鏡下采集，具體過程如下：患者無支氣管鏡檢查禁忌，經口腔置入氣管鏡，在肺部病變部位進行灌洗，灌洗液為滅菌氯化鈉注射液，每次30～50ml，連續灌洗3～4 次后進行回收，回收的灌洗液進行送檢。

1.3 檢驗方法

1.3.1 真菌免疫熒光染色 取待測BALF 標本離心，棄上清液并充分混合沉淀物，取1 滴標本均勻涂在潔凈載玻片上，滴加熒光染液1 滴，蓋上蓋玻片，靜置1min 后鏡檢。結果判讀：鏡下看到亮藍色真菌菌絲或孢子則判定為陽性，鏡下未找到真菌菌絲或孢子則為陰性。

1.3.2 氫氧化鉀濕片法 標本同免疫熒光染色處理后滴加1 滴10%氫氧化鉀溶液，蓋上蓋玻片，酒精燈火焰上微加熱后輕壓蓋玻片，使標本透明，顯微鏡下直接觀察。若高倍鏡下觀察到真菌菌絲或孢子則判定為陽性。如果高倍鏡下未找到真菌菌絲或孢子則判定為陰性。

1.3.3 革蘭染色 標本同免疫熒光染色處理后取適量涂片，經過自然晾干、固定，應用革蘭染片儀進行革蘭染色，應用普通光學顯微鏡進行油鏡下閱片。見到染成紫色的真菌孢子、真菌絲和假菌絲等真菌結構記錄為陽性。

1.3.4 （1,3）-β-D 葡聚糖檢測（G 試驗）采集患者清晨空腹肘靜脈血5ml，標本預處理后根據G 試驗試劑盒說明書進行具體操作，試驗結果以70pg/ml為陽性臨界值。

1.3.5 半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）試驗 BALF標本預處理后根據GM 試驗試劑盒說明書進行具體操作，以待測標本的GM 指數≥0.5 為診斷界值。

1.3.6 隱球菌莢膜多糖抗原檢測 BALF 標本預處理后按照隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑盒（膠體金法）說明書進行具體操作。

1.4 IFPI 判定

參照歐洲癌癥研究治療組織、侵襲性真菌感染協作組等共同修訂的診斷標準[12]，診斷結果分為確診、擬診、疑診。在本研究中通過結合患者病史、臨床癥狀體征、影像學表現、微生物檢測結果等做出相應診斷。將確診和擬診作為真陽性，將疑診及非IPFI 作為真陰性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用例數（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床診斷結果

170 例患者中，臨床確診IPFI90 例，非IPFI80 例。IPFI 病原體分類及3 種檢測方法所得結果，見表1。

表1 IFPI 病原體分類及檢測結果[n（%）]

2.2 BALF 真菌直接鏡檢3 種方法陽性檢出率比較

170 例BALF 標本分別進行免疫熒光染色、氫氧化鉀濕片法、革蘭染色，結果顯示，免疫熒光染色的陽性檢出率為34.7%，明顯高于氫氧化鉀濕片法的陽性檢出率12.4%，差異有統計學意義（χ2=36.10，P＜0.001）；免疫熒光染色的陽性檢出率為34.7%，高于革蘭染色法檢出率4.1%，差異有統計學意義（χ2=50.10，P＜0.001）。

2.3 免疫熒光染色與G 試驗檢測結果及診斷效能比較

170 例高度懷疑IPFI 患者中，有136 例同時進行了BALF 免疫熒光染色及血清G 試驗。以臨床診斷為標準，免疫熒光的敏感度高于血清G 試驗，差異有統計學意義（χ2=16.50，P＜0.001），免疫熒光的特異性低于血清 G 試驗，差異無統計學意義（χ2=1.20，P＞0.05），見表2。

表2 熒光染色和G 實驗檢測結果及診斷效能比較

2.4 真菌熒光染色在不同真菌類型感染中的診斷價值評估

170 例患者中，高度懷疑侵襲性曲霉病的66 例患者同時進行了BALF 免疫熒光染色以及GM 試驗，結果顯示，免疫熒光染色的敏感度高于GM 試驗，差異有統計學意義（χ2=5.80，P＜0.05），免疫熒光染色的特異性高于GM 試驗，差異有統計學意義（χ2=5.10，P＜0.05），見表3。

表3 免疫熒光染色和GM 實驗檢測結果及診斷效能比較

2.5 免疫熒光染色與隱球菌莢膜多糖抗原檢測結果及診斷效能比較

對于高度懷疑隱球菌感染的76 例患者，進行隱球菌莢膜多糖抗原檢測和BALF 免疫熒光染色。隱球菌莢膜多糖抗原檢測顯示陽性36 例，免疫熒光染色檢測顯示其中陽性11 例，陰性25 例；隱球菌莢膜多糖抗原檢測顯示陰性40 例，免疫熒光染色檢測顯示其中陽性2 例，陰性38 例。以臨床診斷為標準，計算兩種檢測方法的敏感度、特異性、陽性預測值和陰性預測值。結果顯示，BALF 隱球菌莢膜多糖抗原試驗的敏感度明顯高于BALF 免疫熒光染色，差異有統計學意義（χ2=19.40，P＜0.001）；兩種檢測方法特異性相同，差異無統計學意義（χ2=0.50，P＞0.05），見表4。

表4 免疫熒光染色和隱球菌莢膜多糖抗原檢測診斷效能比較（%）

3 討論

近年來，侵襲性真菌病的患病率及死亡率呈持續上升趨勢，由于其起病隱匿、臨床表現不典型，早期診斷困難[12,13]。目前侵襲性真菌病的確診依靠組織病理學和（或）無菌標本的培養鑒定，但病理組織的獲取往往需要侵入性操作，無菌標本的培養與鑒定所需時間長并且敏感性低，對疾病的盡早診斷、及時治療帶來了困難[7,12]。

真菌直接鏡檢操作簡單，適用于多種臨床樣本，可快速報告結果，為侵襲性真菌病的盡快診斷提供臨床依據[7]。目前臨床常用真菌鏡檢方法包括免疫熒光染色、氫氧化鉀濕片法、革蘭染色、六銨銀染色等。熒光染色是一種新近發展的鏡檢方法，可用于各種疑似真菌感染的檢查，其染液中的增白劑能特異性的與真菌細胞壁中的β-多糖成分結合，并可吸收一定波長的紫外光，使真菌菌絲和孢子在熒光顯微鏡下呈現黃綠色或淡藍色，與背景形成鮮明對比，容易辨認真菌形態，相較于傳統的氫氧化鉀濕片法和革蘭染色，可避免因檢測人員技術差異而造成的結果不一致，提高真菌檢測的陽性率。既往熒光染色廣泛用于淺表真菌感染的檢測，近幾年來有不少研究證明熒光染色亦可用于深部真菌感染的檢測，相較于氫氧化鉀濕片法有明顯優勢[14,15]。本研究對高度懷疑侵襲性肺部真菌感染患者的肺泡灌洗液進行免疫熒光染色、氫氧化鉀濕片法、革蘭染色，結果提示熒光染色的檢出率與陽性率明顯高于氫氧化鉀濕片法及革蘭染色。

血清學檢查具有耗時短、高敏感型和特異性的優點，臨床常用的血清學檢查方法包括G 試驗、GM試驗、隱球菌莢膜多糖抗原檢測等。（1，3）-β-D-葡聚糖廣泛存在于真菌細胞壁中，當真菌進入人體血液或深部組織后，經吞噬細胞處理后（1，3）-β-D-葡聚糖可從細胞壁釋放出來，從而使其在血液及其他體液中含量升高。本研究顯示真菌熒光染色的靈敏性、陰性預測值、陽性預測值均高于G 試驗，與既往報道相符[16]。需要指出的是，本研究中G 試驗的靈敏性僅為14.7%，低于既往報道[17]，考慮原因如下：①在136 例同時進行BALF 免疫熒光和血清G試驗的患者中，最終有68 位診斷為IPFI，其中肺隱球菌病36 例。既往觀點認為隱球菌細胞壁外莢膜抑制（1，3）-β-D-葡聚糖的釋放，故G 試驗不適合用于隱球菌的檢測，但近來有報道提示G 試驗對隱球菌檢測有應用價值。故本研究進行分析時并未將肺隱球菌病例排除在外。結合本研究結果，G 試驗是否適用于隱球菌檢測有待進一步研究。②造成G 試驗假陰性因素較多，如患者存在巨噬細胞功能缺陷、標本保存不規范等。

GM 試驗檢測的是半乳甘露聚糖，其為廣泛存在于曲霉菌和青霉菌細胞壁的一種多糖，菌絲生長時半乳甘露聚糖從菌絲頂端釋放，是最早釋放的抗原，故用于侵襲性曲霉病的早期診斷，具有較高的特異性。在本研究中66 位患者同時進行了BALF GM 試驗與免疫熒光染色，以臨床診斷為標準，免疫熒光的敏感度、特異性和陽性預測值均高于GM 試驗。隱球菌莢膜多糖抗原通過檢測隱球菌的莢膜莢膜多糖類物質對隱球菌進行檢測，具有較高的敏感度與特異性，本研究結果顯示其敏感度明顯高于免疫熒光染色。

綜上所述，相較于氫氧化鉀濕片法以及革蘭染色，真菌菌絲以及孢子經熒光染色后，輪廓清楚，易于識別，提高了真菌的檢出率及陽性率。此外熒光染色能清楚辨別部分真菌的形態，如毛霉、曲霉、接合菌等，可在早期提供形態學診斷，彌補了真菌培養時間長的缺點。相較于常用的血清學檢測方法，免疫熒光染色亦有相當高的診斷效能。但免疫熒光染色無法排除定值真菌，所以仍需要結合其他檢測方法協助侵襲性真菌病的診斷。