突出核磁共振波譜儀應(yīng)用的藥學(xué)波譜課程 改革與實踐

王耀楠 熊瑜 劉子涵 高岐 馮琦琦 張筱宜 王玉記

1.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，北京 100069；3.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100160；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院，北京 101100

藥學(xué)是連接健康科學(xué)和化學(xué)科學(xué)的醫(yī)學(xué)行業(yè)。藥物小分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定、藥物分子構(gòu)效關(guān)系的研究等化學(xué)科學(xué)相關(guān)知識在藥學(xué)人才培養(yǎng)中占有重要地位。藥物分子是由不同的原子按照一定的規(guī)律排布連接而成，將自旋量子數(shù)不為零的原子置于外加磁場中，原子核的核磁矩會沿著磁場方向排布，此時使用外加的射頻脈沖照射原子核，原子核會吸收射頻脈沖的能量，從低能級躍遷至高能級，核磁矩方向會發(fā)生偏轉(zhuǎn)[1]。當(dāng)把外加的射頻脈沖去掉時，原子核會從高能級弛豫到低能級，核磁矩會恢復(fù)至初始的方向，并將吸收的能量以發(fā)射電磁波的形式釋放，這種現(xiàn)象稱為核磁共振現(xiàn)象，發(fā)射出電磁波的頻率與原子核在分子中的化學(xué)環(huán)境密切相關(guān)，通過解析核磁共振譜圖即可得出與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的信息，核磁共振譜儀已成為鑒定藥物分子結(jié)構(gòu)的必需設(shè)備。目前已有多所高校在本科生的實驗教學(xué)中引入核磁共振譜儀[2-4]，培養(yǎng)學(xué)生使用大型科研儀器的能力。

以核磁共振譜儀為代表的大型儀器在人才培養(yǎng)中的作用日趨重要[5-9]。核磁共振原理相對來說比較復(fù)雜，學(xué)生在學(xué)習(xí)過程中對核磁共振原理的理解有一定困難。核磁共振現(xiàn)象是在實驗過程中發(fā)現(xiàn)的，實驗課程是學(xué)習(xí)核磁共振知識的有效方法。借助于波譜解析課程的教學(xué)改革項目，多所高校在關(guān)于核磁共振的教學(xué)上取得了一些效果[10-13]。還有高校意識到了綜合素質(zhì)對人才培養(yǎng)的重要性，開設(shè)了綜合性的實驗課程，但這些課程彼此之間關(guān)聯(lián)性較弱，學(xué)生只是借助核磁共振譜儀完成了一項獨立的課題[14-17]。為了便于學(xué)生掌握使用核磁共振技術(shù)解析分子結(jié)構(gòu)的技能，首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)專業(yè)在人才培養(yǎng)中設(shè)置了兩種不同層次的課程供學(xué)生進(jìn)行核磁共振譜儀等大型科研儀器設(shè)備的學(xué)習(xí)。本文將從課程的基本設(shè)置、具體實施、效果評價3 個方面探討核磁共振譜儀對藥學(xué)人才培養(yǎng)的意義。

1 層次遞進(jìn)的課程設(shè)置

首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)專業(yè)在人才培養(yǎng)中設(shè)置了藥物的波譜解析和藥學(xué)專業(yè)實驗課程。這兩門課程在層次上是遞進(jìn)的關(guān)系，藥物的波譜解析為藥學(xué)專業(yè)課程，是學(xué)習(xí)核磁共振譜儀的基礎(chǔ)，在本科三年級的第一學(xué)期開展；藥學(xué)專業(yè)實驗課程為擴展性的應(yīng)用課程，在本科四年級第一學(xué)期開展。

1.1 藥物的波譜解析

藥物的波譜解析是藥學(xué)專業(yè)的必修課程，與藥學(xué)相關(guān)的中藥或化學(xué)等專業(yè)也會開設(shè)此課程，其他開設(shè)這門課程的高等院校在教學(xué)活動中進(jìn)行了各種教學(xué)改革，以提升教學(xué)效果[3,4]，首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院在總結(jié)并借鑒了各校優(yōu)秀教學(xué)措施的基礎(chǔ)上，以各種藥物的分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，開設(shè)有藥學(xué)專業(yè)特色的波譜解析課程[10,13]。學(xué)生可以系統(tǒng)性的學(xué)習(xí)與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的四大譜學(xué)知識，掌握解析分子結(jié)構(gòu)的技能。課程分為理論和實驗兩部分，理論課和實驗課各占54 學(xué)時，其中由于核磁共振部分的理論相對復(fù)雜，在學(xué)時分配上有所倚重，占總學(xué)時的三分之一。實驗課程與理論課程緊密相連，學(xué)生在實驗課程中可以通過真實的上機測試圖譜，驗證理論課學(xué)習(xí)的內(nèi)容。

1.2 藥學(xué)專業(yè)綜合實驗

藥學(xué)專業(yè)實驗是涵蓋藥物設(shè)計、合成、分析、評價等全流程的綜合性實驗課程，學(xué)生可以在這門課程中學(xué)習(xí)藥物臨床前研究的整個過程。整個實驗課程的流程設(shè)計按照新藥研發(fā)的步驟開展，學(xué)生需要在判定合成的化合物結(jié)構(gòu)正確之后才可以進(jìn)行分析以及評價部分的實驗。通過化合物結(jié)構(gòu)鑒定的過程，學(xué)生進(jìn)一步鞏固了核磁共振譜儀等大型分析儀器的操作，并且還掌握了圖譜分析的相關(guān)知識。

2 注重實操的課程實施方案

藥學(xué)是一門實驗性較強的學(xué)科，對于波譜解析這種理論知識點繁多且抽象，知識點關(guān)聯(lián)較少的課程，更需借助實驗課程來加深對理論課內(nèi)容的學(xué)習(xí)。

2.1 多測多練，夯實學(xué)習(xí)基礎(chǔ)

在藥物的波譜解析課程中，實驗課程的設(shè)置與理論課程同步進(jìn)行，每周均安排有實驗課程與理論課程相匹配，學(xué)生分成4 組，每組人數(shù)不超過10 人，分別進(jìn)行紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜及質(zhì)譜的實驗，每組均安排專門的教師進(jìn)行帶教實驗，這種小班教學(xué)的模式使得每個同學(xué)都有上機測試譜圖的機會，教師會詳細(xì)介紹儀器的原理和參數(shù)，學(xué)生可以根據(jù)教師的講解親自上機測試。提供給學(xué)生測試的樣品均為常用藥物的原料藥成分，在學(xué)習(xí)儀器操作技能的同時，還可以根據(jù)測試的藥物圖譜驗證理論課學(xué)習(xí)的知識點。

為了增強學(xué)習(xí)效果，在實驗時又將每組學(xué)生分為兩個小組，小組內(nèi)的同學(xué)在上機測試時互相交流，可加深對儀器參數(shù)的理解；由于組內(nèi)同學(xué)所測化合物的結(jié)構(gòu)相近，在譜圖解析時互相討論，還可加深對知識點的理解。以氨基酸衍生物為例，在小組內(nèi)分配化合物時，教師會選擇結(jié)構(gòu)類似的纈氨酸和異亮氨酸的衍生物，以及苯丙氨酸和酪氨酸的衍生物進(jìn)行配對結(jié)構(gòu)分析，研究結(jié)構(gòu)上的變化如何在譜圖上體現(xiàn)。如圖1 所示，左側(cè)為纈氨酸芐酯的氫譜，右側(cè)為異亮氨酸芐酯的氫譜，兩個化合物結(jié)構(gòu)上的差異在于異亮氨酸比纈氨酸多了一個亞甲基，其余部分的結(jié)構(gòu)類似，在異亮氨酸的氫譜中可以明顯看到在化學(xué)位移1.25 和1.41 處多了兩個積分面積為1的信號峰，且由于兩個化合物結(jié)構(gòu)中甲基臨位結(jié)構(gòu)上的差異，在纈氨酸的氫譜中，化學(xué)位移0.95 和0.92的兩個積分為3 的兩重峰均為甲基信號峰，而在異亮氨酸的結(jié)構(gòu)中，化學(xué)位移0.88 處積分為3 的甲基信號為兩重峰，化學(xué)位移0.85 處積分為3 的甲基信號峰為三重峰。

圖1 纈氨酸和異亮氨酸的核磁共振氫譜（局部）圖

對于苯丙氨酸和酪氨酸來說，結(jié)構(gòu)上的差異主要在結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)部分，從圖2 可以看出，左側(cè)酪氨酸芐酯的氫譜中，化學(xué)位移9.43 處的信號峰代表酚羥基的信號，同時在化學(xué)位移6.96 和6.68 處的兩個二重峰的耦合常數(shù)均為8Hz，積分面積均為2，這些均是明顯的苯環(huán)對位取代的信號峰，這些在右側(cè)的苯丙氨酸芐酯中均未觀察到。

圖2 酪氨酸芐酯和苯丙氨酸芐酯的核磁共振氫譜（局部）圖

通過以上簡單的兩個例子，同學(xué)們復(fù)習(xí)了理論課上學(xué)到的化學(xué)位移、耦合常數(shù)和積分面積3 個與氫譜相關(guān)的知識點。類似的結(jié)構(gòu)相似化合物還有很多，學(xué)生在譜圖解析時通過彼此討論，互相比對，印證理論課上學(xué)到的知識點，這樣就能激發(fā)學(xué)習(xí)核磁共振相關(guān)知識的興趣，提升學(xué)習(xí)的效果。

2.2 自主上機，加強實際應(yīng)用

為了讓學(xué)生對所學(xué)知識融會貫通并對藥物臨床前研究的所有環(huán)節(jié)有所了解，藥學(xué)院以自身的科研成果為基礎(chǔ)，設(shè)計了涵蓋藥物設(shè)計、合成、分析、評價等全流程的綜合性實驗課程[18]。在這個實驗課程中，學(xué)生需要從藥物設(shè)計的原理出發(fā)，根據(jù)計算機藥物輔助設(shè)計的計算結(jié)果，從氨基酸原料開始先導(dǎo)化合物的合成，并利用核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜等設(shè)備對合成的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，確定合成的結(jié)果正確之后再進(jìn)行藥劑學(xué)方面的工作，制備納米脂質(zhì)體，最后選擇合適的動物模型，對制備好的劑型進(jìn)行生物活性評價。本課程在大四的第一學(xué)期開設(shè)，學(xué)生需要獨立完成全部實驗內(nèi)容。在此之前，學(xué)生已經(jīng)修完了藥物化學(xué)、藥物分析、藥劑學(xué)以及藥理學(xué)的專業(yè)課程，在完成實驗的過程中，學(xué)生會綜合用到學(xué)過的專業(yè)知識，核磁共振在這里是作為目標(biāo)產(chǎn)物鑒定的主要工具，學(xué)生需要根據(jù)波譜解析課程中學(xué)習(xí)的知識，完成樣品制備、上機測試以及譜圖分析的全過程。

本實驗課程用到的化合物之一，是多肽和小分子藥物。作為北京市重點實驗室的科研成果，合成路線成熟，學(xué)生們只需按照實驗講義的操作步驟即可順利完成，但在處理完化學(xué)反應(yīng)、完成純化之后需對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，就必須要用到核磁共振譜儀才能實現(xiàn)。前期在波譜解析課程中已經(jīng)學(xué)習(xí)過樣品的制備以及上機測試的內(nèi)容，因此在這個綜合實驗課程中，教師只需從旁監(jiān)督，協(xié)助學(xué)生即可完成實驗。本實驗的關(guān)鍵步驟是在最后一步的合環(huán)反應(yīng)，合環(huán)前后的化合物的氫譜，見圖3。

圖3 方框中標(biāo)出的化學(xué)位移1.39 和1.25 處，積分面積為3 的兩個單峰，對應(yīng)分子結(jié)構(gòu)中利用丙酮和兩個氮原子反應(yīng)生成的五元環(huán)上連接的兩個甲基，由于五元環(huán)與左側(cè)的平面結(jié)構(gòu)相連，連接的兩個甲基處于環(huán)的不同平面，造成了化學(xué)位移上的差異。此外，從氫譜上還可以觀察到更多的信息，如結(jié)構(gòu)中的其他氫原子的信號，分別向低場和高場移動，需要對信號進(jìn)行歸屬后再具體分析。在歸屬的過程中，僅依靠氫譜圖提供的信息并不能對信號進(jìn)行完全的指認(rèn)，比如處在飽和六元環(huán)上的兩個亞甲基上的氫原子，它們分別處在環(huán)上碳原子的平伏鍵和直立鍵，化學(xué)位移差異較大，對它們的精確歸屬需借助核磁共振二維譜的信息。這也能激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)二維譜的興趣。

圖3 合環(huán)前的化合物與合環(huán)后的化合物的核磁共振氫譜（局部）圖

3 以靈活運用為目標(biāo)的教學(xué)效果評價

將學(xué)到的知識靈活運用，是學(xué)習(xí)的最終目標(biāo)。教學(xué)效果評價的方式分為3 個層面。第1 個層面是以習(xí)題為主要形式，除了如磁矩、磁化矢量、弛豫等原理性的知識點以外，對于其他關(guān)于實際應(yīng)用的知識點，如化學(xué)環(huán)境如何影響化學(xué)位移，連接方式如何影響信號峰的裂分和耦合等內(nèi)容，以應(yīng)用為目標(biāo)進(jìn)行考核。除了期末考試之外，在學(xué)期中間也安排有階段性的考核，針對前期所講授的內(nèi)容進(jìn)行教學(xué)效果評價。階段性考核的形式以譜圖解析的練習(xí)題為主，在解析圖譜的過程中強化對知識點的理解并增強學(xué)生的解譜能力，注重對學(xué)習(xí)過程的考核，避免學(xué)生期末進(jìn)行突擊式的復(fù)習(xí)而忽視對知識的運用，督促其將學(xué)習(xí)的精力放在日常的課業(yè)中。

效果評價的第2 個層面，是以小組協(xié)作的方式開展，在平時的實驗課程中，除了每個人自己測試并解析的圖譜以外，每個小組會分配一個固定的未知化合物進(jìn)行圖譜測試，在4 次實驗課結(jié)束后，這個未知化合物的全套圖譜都將測試完成，最后1 次課程會以小組匯報演講的形式解析未知化合物的結(jié)構(gòu)，小組成員需要分工協(xié)作并互相討論，確定化合物結(jié)構(gòu)后再以演講的形式介紹團(tuán)隊解析的結(jié)果。在這個過程中，小組內(nèi)的每個成員都需要集思廣益，為本組分配的化合物結(jié)構(gòu)解析獻(xiàn)言獻(xiàn)策，除了核磁共振提供的信息之外，還需要借助質(zhì)譜、紅外等譜圖提供的信息進(jìn)行確認(rèn)。最終的展示環(huán)節(jié)也是對同學(xué)們演講能力的一個提升，切實踐行全方位培養(yǎng)藥學(xué)人才的育人理念。

效果評價的第3 個層面，是重點考察對知識的運用能力，依托于藥學(xué)專業(yè)實驗中對目標(biāo)化合物鑒定的過程。由于此實驗的定位是需要每個同學(xué)獨立完成的綜合性實驗，實驗過程緊湊且連續(xù)，需要根據(jù)合成目標(biāo)化合物鑒定的結(jié)果開展后續(xù)實驗，如果鑒定過程出現(xiàn)問題，勢必會影響后續(xù)分析及評價的實驗部分。核磁共振提供的信息對化合物的鑒定尤為重要，這就需要學(xué)生留意從樣品制備到上機測試以及最終獲取核磁共振譜圖的所有細(xì)節(jié)，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均會影響最終的實驗結(jié)果。能夠獨立操作核磁共振譜儀進(jìn)行譜圖采集并進(jìn)行譜圖解析、鑒定合成的化合物，順利完成最終實驗的同學(xué)，也就完成了核磁共振相關(guān)知識運用能力的考核。

4 結(jié)語

藥物的波譜解析和藥學(xué)專業(yè)實驗課程，在課程設(shè)置的層次上逐步遞進(jìn)，在教學(xué)內(nèi)容的把控上將理論知識與上機操作置于同等重要的地位，在教學(xué)效果的評價上注重對學(xué)生知識運用能力的考核。藥學(xué)專業(yè)的本科生在學(xué)習(xí)藥物的波譜解析和藥學(xué)專業(yè)實驗課程后，對于核磁共振波譜儀等大型儀器均能夠熟練操作，初步具備了未知化合物結(jié)構(gòu)解析的能力。核磁共振譜儀在藥學(xué)人才的培養(yǎng)中發(fā)揮了重要作用。