三七總皂苷預處理通過激活HIF-1α/BNIP3線粒體自噬信號通路減少心肌細胞H/R損傷的機制研究

王麗紅 韓勇 王超海 詹舟虹 盧夢愷 金佳煒 劉新文

紹興文理學院附屬醫院（紹興市立醫院）藥劑科，浙江紹興 312000

心肌缺血缺氧導致心肌細胞損傷，隨后恢復血流和氧氣產生大量氧自由基，這種心肌細胞缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）過程會造成大量心肌細胞凋亡，引起心肌損傷，減少心肌細胞H/R 損傷是改善患者預后的保障[1,2]。線粒體自噬是細胞自發清除損傷或衰老線粒體的過程，近年研究發現線粒體自噬與神經退行性疾病和癌癥等諸多生理病理過程密切相關，這對修復心肌細胞H/R 損傷有重要意義，與線粒體自噬相關的信號通路也逐漸引起研究者的關注[3,4]。低氧誘導因子-1α（hypoxic inducible factor-1 α，HIF-1α）是細胞氧氣信號傳導通路的核心組成部分，常氧下HIF-1α 表達極為有限，僅在低氧條件下能夠實現穩定高表達，HIF-1α 蛋白參與代謝、缺氧適應、血管生成和炎癥發展等重要過程[5]。B 淋巴細胞瘤-2/腺病毒E1B 19kDa 相互作用蛋白3（b lymphocytoma-2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3）能發揮促細胞凋亡和線粒體自噬的重要作用，因此，通過調節HIF-1α/BNIP3 線粒體自噬信號通路表達，能夠調控線粒體自噬過程，進一步在減少心肌細胞H/R 損傷中發揮作用[6]。研究表明，三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）可以通過抑制細胞凋亡減少心肌缺血細胞，縮小心肌梗死范圍，抑制血小板聚集黏附以及改善微循環，但其保護心肌的具體作用機制尚無定論[7,8]。本研究探討了PNS 是否通過調節HIF-1α/BNIP3 線粒體自噬信號通路發揮減少心肌細胞H/R損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人H9c2 心肌細胞購自上海博湖生物科技有限公司；PNS 和二甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME2）由上海廣銳生物科技有限公司提供；DMEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自江蘇齊氏生物科技有限公司；酶聯免疫試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司；β-actin 人單克隆抗體LC3、HIF-1α 和BNIP3 單克隆抗體，均購自美國Abcam 公司。CO2培養箱購自ThermoFisher Scientific公司；Infinite 200 PRO 多功能酶標儀購自瑞士TECAN 公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.2 細胞培養

采用含質量分數10% FBS 的DMEM 培養液培養H9c2 心肌細胞，于37℃、5% CO2培養箱中培養，隔天換液，使培養的H9c2 心肌細胞完全貼壁。

1.3 H9c2 心肌細胞H/R 損傷模型建立與分組

1.3.1 H/R 損傷建模方法 待H9c2 心肌細胞完全貼壁后，棄去細胞培養液，每孔加入100μl 不含FBS的無糖DMEM 培養基（細胞缺氧液），將細胞培養板轉移至密閉缺氧盒中，持續通氮氣10min 除去氧氣，置于CO2培養箱中缺氧培養3 h，然后除去細胞缺氧液，每孔加入100μl 體積分數10%FBS 的高糖DMEM 培養基，將細胞培養板置于CO2培養箱中復氧培養[9]。

1.3.2 分組 ①對照組：即正常心肌細胞組，按照1.2 步驟常規培養H9c2 心肌細胞；②模型組：即經過缺氧培養的H/R 損傷的細胞組，根據上述1.3.1 的H/R 損傷模型的建立方法，建立H/R 損傷模型，模型組僅建模，不加任何藥物干預；③2-ME2 組：即在含2-ME2 培養液中培養H/R 損傷的H9c2 心肌細胞；④PNS組：建立模型的基礎上，在培養液中加入PNS(50μg/ml)，PNS 濃度根據文獻和預實驗決定；⑤P NS+2-ME2 組：在培養液中加入2-ME2，10min 后加入PNS(50μg/ml)，培養H/R 損傷的H9c2 心肌細胞。

1.4 心肌細胞損傷檢測

采用酶聯免疫吸附法測定肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate amino transferase，AST）水平。將包被好的酶標板用PBS緩沖液沖洗3 次，緩沖液封閉，每孔100μl，37℃下放置30min。封閉好的板加標準品或待測H9c2 心肌細胞懸浮液各3 孔，每孔50μl，室溫放置4h，每孔加入50μl 酶標抗體，室溫反應1h，加入底物鄰苯二酚胺1 滴顯色，帶標準曲線梯度明顯時用硫酸終止反應，讀取490nm 下吸光度值，所有操作嚴格按照說明書要求執行[10]。

1.5 心肌細胞自噬活性檢測

取各組對數生長期H9c2 心肌細胞培養48h 后棄培養基，質量分數4%甲醛固定10min，200μl Triton-X作用30min，采用3%FBS 封閉，加入細胞自噬標志物LC3 一抗孵育過夜，加入熒光耦聯二抗，37℃孵育1h 后封片，熒光顯微鏡下觀察LC3 熒光斑點數。

1.6 線粒體自噬信號通路表達檢測

取各組H9c2 心肌細胞，采用細胞裂解液裂解，提取總蛋白，嚴格按照操作說明進行。采用BCA 法進行蛋白定量，取50ng 蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜，室溫封閉2h，采用洗膜緩沖液洗膜并加一抗（LC3、HIF-1α 和BNIP3），于4℃孵育過夜，洗膜加二抗，于室溫下孵育2h。電化學發光顯影，用凝膠圖象處理系統分析對比條帶強弱，選用β-actin作為內參[11]。

1.7 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件對數據進行處理分析，滿足正態性的計量資料以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同處理后心肌細胞損傷比較

與對照組相比，模型組CK、LDH 和AST 水平均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，PNS 組和PNS+2-ME2 組CK、LDH 和AST水平均明顯降低，2-ME2 組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同處理后心肌細胞損傷比較（ ）

表1 不同處理后心肌細胞損傷比較（ ）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

2.2 不同處理后心肌細胞氧化應激比較

與對照組相比，模型組ROS 含量和MDA 水平均明顯升高，SOD 含量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，PNS 組和2-ME2+PNS組MDA 水平和ROS 含量明顯降低，SOD 含量明顯升高；2-ME2 組MDA 水平和ROS 含量明顯升高，SOD含量明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同處理后心肌細胞氧化應激比較（ ）

表2 不同處理后心肌細胞氧化應激比較（ ）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

2.3 不同處理后心肌細胞自噬活性比較

免疫熒光實驗檢測結果顯示，與對照組相比，模型組心肌細胞LC3熒光斑點數明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，PNS 組和2-ME2+PNS 組心肌細胞LC3 熒光斑點數明顯增加，2-ME2 組LC3 熒光斑點數明顯減少（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同處理后心肌細胞自噬活性比較

2.4 不同處理后心肌細胞線粒體自噬信號通路表達比較

與對照組相比，模型組LC3、HIF-1α 和BNIP3表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，PNS 組和PNS+2-ME2 組LC3、HIF-1α 和BNIP3 表達水平明顯升高，2-ME2 組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2，表3。

圖2 心肌細胞線粒體自噬信號通路表達比較凝膠條帶

表3 不同處理后心肌細胞線粒體自噬信號通路表達比較（ ）

表3 不同處理后心肌細胞線粒體自噬信號通路表達比較（ ）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05

3 討論

AST 在心肌內含量豐富，對診斷心肌梗死等疾病有一定意義；發生心肌損傷時，胞內物質外漏至細胞間液及外周血中，造成LDH 升高；CK 在各種類型進行性肌萎縮時活性增高[12,13]。本研究結果顯示，經PNS 干預后心肌細胞損傷有所緩解。PNS 預處理能夠降低心肌細胞CK、LDH 和AST 水平，說明PNS 具有心肌保護作用，而2-ME2 組上述水平明顯增加，說明2-ME2 一定程度上會損害心肌細胞，PNS+2-ME2 組CK、LDH 和AST 水平升高說明PNS能夠逆轉2-ME2 的損傷作用。氧化應激研究結果表明模型組心肌細胞氧化應激水平較高，這可能是其心肌細胞受損嚴重程度高的可能原因之一。使用PNS預處理后，心肌細胞內的氧化應激水平有所緩解，2-ME2 減輕H/R 引起的心肌細胞凋亡，對H/R 損傷的心肌細胞具有顯著保護作用。

LC3 參與自噬體形成，是自噬的重要分子標志物之一，為了從自噬的角度進一步解釋這種現象，本研究采用免疫熒光實驗檢測各組心肌細胞自噬活性[14]。本研究結果顯示模型組和經PNS 干預的心肌細胞自噬活性均明顯升高，這可能是因為當心肌細胞受損后，機體為代償性修復損傷而激活心肌細胞自噬過程，而PNS 則推進了自噬進程以促進更高效的保護作用。既往研究結果顯示，自噬在缺血再灌注過程中具有雙向調節作用，這種作用效果取決于對自噬的刺激程度，適度自噬可以清除受損細胞器發揮保護作用，而過度的自噬水平則會進一步損傷心肌細胞[15]。多數研究者認為H/R 發生的基礎是能量代謝障礙，而線粒體是體內能量代謝的主要場所，其功能損傷能夠直接導致機體能量代謝異常[16]。線粒體對缺氧導致的損傷極為敏感，缺氧早期受損線粒體常通過選擇性自噬發揮保護作用。HIF-1α 作為低氧反應過程中的核心因子，在介導低氧信號通路中發揮著至關重要的作用。同時，BNIP3 作為一種線粒體外膜蛋白，在缺氧條件下其表達增加也會促進線粒體自噬以清除受損線粒體[17,18]。2-ME2 是不可逆HIF-1α 通路抑制劑，能夠使微管解聚并抑制HIF-1α 核積累以及HIF 轉錄活性，抑制線粒體自噬過程，本研究結果顯示，使用2-ME2 干預后再加入PNS，這種線粒體自噬效應被逆轉，這一結果從分子學角度說明PNS 能通過作用于HIF-1α/BNIP3 線粒體自噬信號通路，引起線粒體選擇性自噬，快速清除體內受損線粒體，更有效地保護心肌細胞[19]。既往研究顯示，BNIP3 在正常生理條件下處于低表達水平，而當細胞缺氧時，活化的 HIF-1α 通過上調BNIP3 引起自噬調控蛋白Beclin1 從B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因中解離，釋放Beclin1 激活自噬，與本研究結果基本一致[20]。

綜上所述，本研究分析了 PNS 能夠作用于HIF-1α/BNIP3 線粒體自噬信號通路發揮減少心肌細胞H/R 損傷的作用，推進了臨床利用線粒體自噬通路提供相關治療的進展。