對高致病性禽流感診斷技術的有關思考

摘要：高致病性禽流感（HPAD是當前對全球家禽養殖業危害最大的禽類烈性傳染病，不僅涉及養殖業健康發展、野生動物安全、動物源食品安全，也是全球公共衛生的主要問題之一。本文梳理了全球高致病性禽流感流行概況，綜述了禽流感診斷技術，對臨床診斷及樣品采集、禽流感病毒血清學檢測技術等進行概述，以期我國HPAl的防疫和控制措施提供參考。

關鍵詞：禽流感；HPAl;疫病防控；公共衛生

1 禽流感病毒的概述

流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，單股負鏈分節段RNA病毒。根據核蛋白和基質蛋白抗原性的不同，國際病毒分類委員會對流感病毒的最新分類分為α，β，Y和δ四個屬。目前關注最多是a流感病毒屬，如禽流感病毒等。根據病毒的致病性，禽流感病毒分為高致病性禽流感病毒（HPAI）和低致病性禽流感病毒（IPAI）[1]。目前來看，絕大多數禽流感病毒都是低致病性禽流感病毒；少數H5和H7亞型是高致病性禽流感病毒。

2 高致病性禽流感流行概況

2005-2021年，高致病性禽流感已導致全球3 16億多只家禽死亡和撲殺。據統計，2021年，全球共有65個國家和地區報告發生高致病性禽流感（HPAI）疫情4.376起，超1，200萬只禽類被感染，其中約516萬只死亡，至少4. 700萬只被撲殺。

此外，人偶爾也會感染禽流感病毒。據WHO統計，人感染H5N1亞型約850例，其中約半數出現死亡；人感染H7N9約1，500例，死亡約600例、感染H5N6病例約80例，死亡約30例。目前，HPAI僅限于H5和H7亞型高致病性禽流感病毒（HPAIV）引起的疫病。禽流感不僅會對養殖業造成嚴重危害，而且會給人類健康帶來巨大威脅[2]。

3 禽流感診斷技術的綜述

國際上禽流感診斷的依據是世界動物衛生組織出版的WOAH陸生動物法典和WOAH陸生動物診斷試驗和疫苗標準手冊。我國對禽流感診斷的依據主要有國家標準、行業標準等，其中重要是2020年發布實施的《高致病性禽流感診斷技術》 （GB/T 18936-2020）國家標準。2020年新修訂的版本比舊版內容更系統，增加了流行病學的臨床診斷，樣品的采集、保存和運輸等內容，病毒分離后實驗室鑒定方法包括HA-HI試驗、RT-PCR方法以及熒光RT-PCR方法，最后結合流行病學特征和實驗室檢測結果進行綜合判定。此外，有些試驗操作過程和注意事項在附錄中體現，其中最重要的2個：一是IVPI測定試驗，該試驗只能在動物生物安全三級實驗室中進行；二是血清非特異性凝集和非特異性抑制因子的處理方法，有些禽類血清需要用該方法處理后再進行HA和Hl試驗。

4 臨床診斷及樣品采集

4.1 關于樣品采集

開展實驗室診斷的第一步是樣品采集、保存與運輸環節。考慮到高致病性禽流感對生物安全的要求較高，所以樣品采集應注意以下條件：①樣品采集宜在發病初期選擇具有典型臨床癥狀的禽進行，采樣過程中應避免交叉污染；②死禽主要采集氣管、肺、腦、肝臟等組織進行病毒的檢測、分離；③活禽可以采集咽喉和／或泄殖腔拭子；④采集咽喉拭子時要深入喉頭及上顎裂來回刮蹭并旋轉，取分泌液。采集泄殖腔拭子時將拭子深入泄殖腔旋轉并沾取少量糞便；⑤血清樣品采集。血清樣本要盡量避免溶血，污染等情況。

4.2 樣品的保存和運輸

樣品采集后置保溫箱中，加入預冷的冰袋，密封，宜24h內送實驗室。樣品應盡快處理，沒有條件的可在4℃存放不超過4d，也可在低溫條件下保存（-70℃貯存為宜）。如果路途短，可以直接放上冰袋運輸，如果路途較遠，可以放干冰運輸。運輸的時候，按生物安全要求進行包裝，防止發生泄漏。

5 禽流感病毒核酸檢測方面

禽流感屬于高致病性病原，對生物安全的要求較高。首先要選擇有資質的高等級生物安全實驗室，采集禽組織（勻漿物）、拭子和糞便等，通過雞胚（9～11日齡）尿囊腔接種的方法進行病毒分離。利用HA-HI、IVPI、RT-PCR、熒光RT-PCR等方法做進一步鑒定。

5.1 常規RT-PCR方法

2020版整合了農業行業標準《禽流感病毒RT-PCR檢測方法》（NYIT 772-2013），規定了通用、H5、H7、H9、N1、N2、N9等亞型禽流感病毒的RT-PCR檢測技術，適用于檢測禽組織、分泌物、排泄物和雞胚尿囊液中禽流感病毒的核酸。

5.2 熒光RT-PCR方法

2020版本整合了4項國家標準，規定了通用、H5、H7、H9、N6、N8、N9等亞型的熒光定量RT-PCR檢測技術，適用于檢測禽組織、分泌物、排泄物和雞胚尿囊液中禽流感病毒的核酸。

5.3 實驗室條件

在開展PCR或者RT-PCR的核酸檢測時，對實驗室條件有一定要求：儀器設備方面，應該配有PCR儀、熒光定量PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等；操作區域分區：RNA提取區、RT-PCR配液區、基因擴增區、電泳區，不同區域要相互隔離；實驗人員要接受過RT-PCR操作專業培訓，掌握防止RNA降解、核酸（含擴增產物）污染和EB污染的具體措施，熟悉試劑的檢驗和結果的判斷方法。

5.4 操作程序

所有實驗都應設立陰性和陽性對照。在購買的成品檢測試劑盒中通常都包含陰性和陽性質控品。在RNA提取時，常用磁珠法或柱模法。RNA擴增體系的配制過程，人員進入后要換工作服，保證環境的潔凈度。下一步，將模板加入到擴增體系中，進行PCR或熒光定量PCR反應，反應結束后通過電泳或實時熒光曲線分析進行結果判定。

5.5 注意事項

RT-PCR檢測的試劑由專人負責整理、分裝、保存；避免實驗人員或其他人員在實驗臺面周圍走動；RNA提取時，須穿上工作服，帶上帽子和口罩，并勤換手套；避免說話，尤其是對著操作的物品或臺面說話，避免中斷操作接聽手機和電話等其他事務；手指不要接觸離心管口的內壁，盡可能用鑷子替代手去取用東西。核酸提取步驟必須使用帶濾芯的吸頭；10UL以內的使用長吸頭，且加樣時要輕，吸取與模板有關的液體時避免反復吹打；移液器與吸頭盒嚴格分開（核酸提取、反應液配制、電泳加樣）；擴增產物只是在電泳區域打開，禁止將電泳區的吸頭盒和移液器帶回上游實驗室；實驗室須消毒（10%次氯酸鈉消毒桌面、普通消毒水消毒地面和器皿；75%酒精棉球擦拭槍體），注意通風。

6 禽流感病毒血清學檢測技術

血清學檢測包括血凝試驗、血凝抑制試驗、病毒中和試驗、乳膠凝集試驗、免疫膠體金試驗、瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附試驗和免疫組化試驗。禽流感病毒檢測主要用血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI），原理非常簡單。HA試驗原理就是病毒表面的血凝素與多種動物的紅細胞表面受體結合，出現紅細胞凝集現象。Hl試驗原理就是病毒的紅細胞凝集現象可以被特異性免疫血清抑制，加入特異性免疫血清之后，病毒就不能與紅細胞發生凝集反應。

在進行Hl試驗之前，要進行4個血凝單位（HAU）抗原的配制。具體方法如下：首先根據血凝價去配制，假設效價是1：256，則4 HAU=256/4=64；取6.3 mL PBS，加入0.1 mL抗原，即將抗原1：64稀釋獲得4 HAU；之后是最重要的一步，即對4 HAU進行驗證。在2020版國標里添加了對這部分內容的詳細說明，首先將4HAU抗原進行系列稀釋，使最終稀釋比例分別為1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7；然后取25UL稀釋的抗原+25μ L PBS+25μ L l%紅細胞，混勻反應；如果配制的抗原為4 HAU，則1：4稀釋將出現凝集終點；如果高于4 HAU，可能1：5或1：6稀釋為終點；如果低于4HAU，可能1：2或1：3稀釋為終點。

HA與Hl試驗有許多優點，操作比較簡單，不需要精密的儀器，有些公司開發了專門的儀器來進行結果判讀，被廣泛地應用于禽流感病原鑒定和抗體檢測；缺點是用雞紅細胞檢測哺乳動物和水禽血清時，需除去血清中的非特異凝集素，再就是試驗結果判定具有主觀性。

7 關于高致病性禽流感病毒綜合判定

一是疑似感染高致病性禽流感病毒。可根據發病禽的臨床癥狀、剖檢變化等情況，初步判為高致病性禽流感臨床疑似病例，且H5或H7亞型的RT-PCR或實時熒光RT-PCR檢測陽性，可判為高致病性禽流感疑似病例[3]。二是確診。病毒分離物經HA和Hl試驗確定為流感病毒，且分離物的IVPI值大于1.2，判定為高致病性禽流感病毒；如果IVPI值小于1.2的H5或H7亞型禽流感病毒，在HA裂解位點處具有與HPAI病毒相似的氨基酸序列，亦判定為高致病性禽流感病毒。分離到高致病性禽流感病毒的病例判定為高致病性禽流感確診病例。

8 做好高致病性禽流感的防控思考

一是2021年全球HPAI疫情流行嚴重，呈季節性暴發，流行范圍擴大，形勢嚴峻，尤其是H5N1亞型有再次大流行的風險，需要密切關注全球疫情動態，加強疫情監測，提高預警和應急反應能力[4]。二是秋冬季節氣溫較低，家禽抵抗力下降，病毒存活能力增強，且候鳥遷徙導致高致病性禽流感病毒傳播風險加大，養殖場戶應進一步做好高致病性禽流感防控工作。三是要針對不同飼養周期的家禽，制定科學合理的免疫程序，確保基礎免疫完善，及時補免。對于靠近野外環境的場區，要安裝防鳥網，防止野禽和家禽接觸。四是秋冬季節，室內外溫差大，要保證禽舍的密閉性和保溫性，做好潮濕盒結塊墊料的清理工作。

參考文獻：

[1]胡昌明高致病性禽流感的流行特點以及防控手段[J]吉林畜牧獸醫，2022.43（2）：44-45

[2] 邱玉濤，柯艷坤，龔海燕2021年動物高致病性禽流感疫情的個球流行特征分析[J]中國獸醫雜志，2022，58（6）．1-8

[3] 劉建文，李月輝高致病性禽流感疫情動態及公共衛生風險分析[J]家禽科學.2021（10）：20-22

[4]曹蕓，陳霞，戴玉嬌，等2021年全球高致病性禽流感疫情分析[J]中國動物榆疫.2022，39（6）：19-23