大腸桿菌ESBLs基因克隆表達載體的構建與鑒定

摘要：大腸桿菌是一種最常見的革蘭氏陰性菌，是一種常見的條件性致病菌。由于在治療大腸桿菌時抗生素的大量使用，使大腸桿菌產生了很多耐藥基因，其中超廣譜β -內酰胺酶對許多p-內酰胺類抗生素具有耐藥性，且以其中的CTX-M型為主，為了更好地研究產超廣譜β -內酰胺酶，本次實驗通過設計并擴增產超廣譜p-內酰胺酶的CTX-M-3基因，并通過Ndel、XhoI兩種限制性內切酶酶切并連接，預計構建pET42b-ESBLs的原核表達載體，并送往上海生工公司進行測序，并對測序結果的遺傳相似性及遺傳進化進行分析，由于引物的特異性或模板的特殊性，測序結果顯示擴增結果為DH5a染色體基因組并構建的載體是DH5a染色體基因的原核表達載體。

關鍵詞：大腸桿菌；超廣譜β -內酰胺酶；PCR擴增；CTX-M

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中尤其是人與動物腸道中，可以在腸道內引起各種病理性感染。大腸桿菌的耐藥性使得這些感染的治療變得困難，大腸桿菌的耐藥性在不斷地發展，在大腸桿菌的多種耐藥基因中，超廣譜β一內酰胺酶（Extend-ed-spectrum β -lactamase，ESBLs）引起了廣泛的關注。產超廣譜β -內酰胺酶的大腸桿菌對許多β一內酰胺類抗生素具有耐藥性，包括青霉素、氨曲南和大多數頭孢菌素[1]。由于耐藥性的存在，在使用抗生素后，大腸桿菌還是會出現在人或動物的腸道中[2]。大腸桿菌通常通過糞便一口腔途徑傳播[3]，多種耐藥型ESBLs大腸桿菌可通過與人、動物或環境接觸，或攝入受污染的食物或水傳播[4]。

大腸桿菌的ESBLs可分為SHV型、CTX-M型、TEM型、OXA型和其他型（VEB、GES、PER）5大類[5]。由于頭孢菌素類抗生素的廣泛使用，ESBLs大腸桿菌耐藥程度也不斷加重，且以CTX-M型耐藥基因為主，TEM型和SHV型耐藥基因次之[6-7]。目前，在全世界范圍內，已經有超過200種ESBLs基因型的存在。而且產ESBLs的大腸桿菌對一些抗菌類藥物有著較強的抵抗能力，我國的產ESBLs菌株主要是分解頭孢噻肟的CTX-M型[8]很大程度上影響了臨床治療的效果，本實驗擬通過擴增ESBLs基因的并構建pET-42b-ESBLs原核表達載體，為進一步研究ESBLs基因及其生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體

pET-42b載體、大腸桿菌DH5 a感受態細胞及大腸桿菌BL21感受態細胞均由塔里木大學重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

核酸染料Golden View購自博邁德生物公司，DNA Marker、Easy Taq mix酶、Xho l、Nde I內切酶、T4 DNA連接酶均購自全式金生物技術有限公司，通用型DNA純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒均購自北京天根生物工程技術服務有限公司。

1.3 引物設計

根據GeneBank中已公布的CTX-M-3的基因序列（登錄號：AB168117.1），使用SnapGene軟件設計特異性引物，上、下游引物分別加上Nde I、Xho I兩個酶切位點，并添加相應的保護性堿基，由SnapGene軟件預測出構建載體圖譜（圖1），引物序列（表1），預計片段大小為876bp。引物由上海生工公司合成。

1.4 ESBL基因擴增

使用大腸桿菌的疫苗株作為模板進行擴增，PCR擴增體系25μL：2×Easy Taq mix酶12. 5μL，上、下游引物各1μL，模板1μL，ddH20 9. 5μL。反應體系：95℃預變性5min：95℃變性30s，53℃退火延伸30s，72℃延伸90s，共35個循環；72℃再延伸10m in。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收。

1.5 ESBLs基因重組原核表達載體的構建

將pET-42b載體及擴增產物用Xho I及Nde l兩個限制性內切酶37。C酶切30min，并回收。將酶切完的載體及目的基因進行同源重組，插入片段與載體摩爾比為3：1，連接反應體系：載體1μL，目的片段3μL，10×ligation buffer 2μL，T4 DNA ligase 1μL，ddH2O 13UL。16。C水浴連接8h。然后將連接產物轉化到大腸桿菌DH5 a感受態細胞內，挑選陽性菌落，經過菌液PCR鑒定正確提取質粒并進行雙酶切鑒定后，將鑒定正確的質粒送上海生工公司進行測序。

1.6 測序結果分析

從GenBank數據庫中獲得CTX-M型、TEM型、OXA型和VEB型等15個基因序列，使用MegAI ig和Mega 11對測序結果進行苷酸和氨基酸序列相似性比對和進化樹分析。

2 結果

2.1 ESBLs基因PCR擴增及原核表達載體的鑒定及表達

以疫苗株為模板對大腸桿菌ESBLs基因進行擴增，獲得了約為876bp的目的條帶（圖2），與預期結果相同。對轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞后的陽性菌落進行鑒定（圖3），對提取的質粒進行雙酶切鑒定（圖4）。

2.2測序結果分析

經上海生工公司測序后發現測序結果與預期結果不相符，使用DNAMAN將上下游引物與測序結果比對后發現測序結果的上下游與引物相符（圖5，6），通過相似性對比發現測序結果與DH5a染色體基因相似性最高，與其他基因型相似性都低于50%（圖7），系統進化樹分析表明與DH5 a染色體基因屬于一個分支關系最近，與大腸桿菌DH5 a衍生物基因NEB及ESBLs基因的不同類型親緣性較遠（圖8）。

3 結論

最近幾年來由于一些抗生素大量且不合理使用導致耐藥菌株逐年增加，特別是產ESBLs菌引起的耐藥現象更為嚴重[9]且這些耐藥菌以CTX-M為主要耐藥基因型[10-12]。而被ESBLs導致的耐藥性研究也成為了研究大腸桿菌耐藥性的熱點[13]并且在動物源產ESBLs大腸桿菌中以CTX-M型流行為主[14]，CTX-M基因型ESBLs其對頭孢噻肟的水解能力最高，同時可水解氨曲南和頭孢曲松，而對頭孢吡肟的水解力很弱[15]有研究顯示ESBLs主要存在于革蘭氏陰性桿菌中，包括肺炎并且克雷伯菌和大腸桿菌而且現在已經成為介導革蘭陰性桿菌對新型廣譜β一內酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機制，而大腸桿菌則是產ESBLs的主要載體[16]。

因此本實驗主要是對大腸桿菌ESBLs基因進行體外擴增、克隆與測序及分析，希望可以為該病的進一步研究以及防治工作、疫苗開發等方面提供參考。

在PCR過程中得到了與預期片段大小相似的片段，并對其進行了酶切、菌液PCR鑒定均發現與預期片段大小相似，提取質粒進行雙酶切鑒定時也出現了質粒片段及目的片段大小相似，但在測序后結果為DH5 a染色體基因，片段大小只相差120bp，在電泳圖中很難區分，只有在經過測序后才能發現，原因可能是由于兩段序列的上下游序列太過于相似，導致擴增出的基因發生了變化。

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