一種賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦生長和水質影響

管立平，謝晶晶，李偉豪，陳昊震，溫振中，孫成波,2,3

(1 廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2 南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)，廣東 湛江 524025；3 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)原產(chǎn)于太平洋沿岸水域，因其具有適應性強生長速度快、產(chǎn)肉率高等優(yōu)點，在世界范圍內(nèi)被廣泛養(yǎng)殖[1]。隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，經(jīng)歷了數(shù)年大規(guī)模高密度養(yǎng)殖，養(yǎng)殖生產(chǎn)中用藥量不斷增加，導致水環(huán)境污染負荷日益加重、病害頻繁發(fā)生、養(yǎng)殖產(chǎn)品質量下降，嚴重影響到了水產(chǎn)品安全和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，促使人們越來越關注通過運用微生物制劑凈化養(yǎng)殖尾水及循環(huán)利用的研究及方法[2-5]。

微生物制劑被廣泛運用及微生物制劑的研究證實有利于增強養(yǎng)殖凡納濱對蝦的免疫能力和提升凡納濱對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)的綜合效益，但在凡納濱對蝦養(yǎng)殖的過程中，需充分考慮具體的凡納濱對蝦養(yǎng)殖環(huán)境以及相關影響因子，科學運用微生態(tài)調(diào)控技術，制定有效的凡納濱對蝦養(yǎng)殖方案，保障養(yǎng)殖凡納濱對蝦的品質安全，盡可能降低凡納濱對蝦養(yǎng)殖對環(huán)境的污染，減少疾病的發(fā)生，達到凡納濱對蝦養(yǎng)殖的可持續(xù)的發(fā)展[6]。在常用的微生態(tài)制劑中，芽孢桿菌具有抗逆性強、穩(wěn)定性好、耐氧化、耐酸堿等特點從而成為研究熱點[7]。同時芽孢桿菌具有促進生長和預防疾病的作用，可作為抗生素的替代品、飼料添加劑和水質調(diào)節(jié)控制劑[8-9]。目前國內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖相關研究的芽孢桿菌主要為枯草芽孢桿菌[10]、地衣芽孢桿菌[11]、蠟樣芽孢桿菌[12]和凝結芽孢桿菌[13]，而賴氨酸芽孢桿菌的相關研究主要還是處于分離篩選鑒定試驗中[14]，并未做相關的水產(chǎn)養(yǎng)殖驗證試驗。

本研究通過已篩選出的賴氨酸芽孢桿菌，以持續(xù)潑灑的方式[15]，探討賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦的養(yǎng)殖水質凈化效果和生長指標的影響。

1 材料與方法

1.1 賴氨酸芽孢桿菌

本實驗室從廣東省沿海對蝦地膜精養(yǎng)池篩選的一株賴氨酸芽孢桿菌經(jīng)過PCR 擴增產(chǎn)物，再經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序結果在NCBI上進行BLAST比對分析，以確定菌株的種類和分類地位。

利用 MEGA 7.0 軟件中的基于1 000次bootstrap重復算法的neighbor-joining方法，構建系統(tǒng)進化樹，如圖1所示，可得試驗菌株為賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)成員。配制濃度為0.463×109CFU/mL的賴氨酸芽孢桿菌菌液。

圖1 基于16S rRNA基因序列構建的賴氨酸芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

1.2 試驗對蝦及飼養(yǎng)管理

試驗在廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地內(nèi)進行，利用300 L試驗桶裝經(jīng)過濾沉淀、含氯消毒劑消毒和曝氣的天然海水250 L，放養(yǎng)125尾凡納濱對蝦/桶，微管曝氣增氧，自然光照，試驗全程采用全封閉零交換水模式。凡納濱對蝦取自廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地，平均體長為(9.40±0.18)cm，體質量(5.18±0.13)g，附肢完整、健康、活力好。試驗設1個試驗組和1個對照組，每組設3個平行，量取 25 mL賴氨酸芽孢桿菌菌液，賴氨酸芽孢桿菌使用量為0.463×104CFU/mL，每隔3 d使用1次，試驗10 d。投喂餌料4次/d，投喂6.25 g/次，投喂時間為07：00、11：00、15：00、19：00。

1.3 樣品采集與處理

試驗開始和結束時各測定一次凡納濱對蝦體長和體質量。每天14：00利用注射器抽吸法在水面下方 5.00 cm 處采集水樣并測定對蝦養(yǎng)殖水體溫度、pH和鹽度。

1.4 試驗參數(shù)的計算方法

L=Lt-L0

(1)

W=Wt-W0

(2)

S=(St/S0)×100%

(3)

F=Ft/W

(4)

式中：L為增體長量，cm；Lt為終末體長，cm；L0為初始體長，cm；W為增體質量，g；Wt為終末體質量，g；W0為初始體質量，g；S為存活率；St為終末存活尾數(shù)；S0為初始存活尾數(shù)；F為投飼系數(shù)；Ft為投喂飼料總量。

1.5 水質指標測定方法

銨態(tài)氮含量按照(HJ 535—2009)標準采取靛酚藍法測定[16]；亞硝酸鹽氮含量按照(GB 7493—87)標準采用 N-(1-萘基)-己二胺分光光度法測定[16]；硝酸鹽氮含量按照按(GB 17378.4—1998-39)標準采用鋅-鎘還原法測定[16]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)列出變化趨勢圖和運用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)單因素ANOVA方差分析，試驗數(shù)據(jù)通過平均值+標準差表述[17]。

2 結果

2.1 賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦生長存活的影響

凡納濱對蝦飼養(yǎng)10 d后，凡納濱對蝦的體質量(體長)、存活率及投飼系數(shù)如表1所示，其中整體試驗組存活率(77.07%±1.22%)與對照組存活率(71.73%±2.81%)存在顯著性差異(P<0.05)，而試驗組和對照組的體長(體質量)增長和投飼系數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，但試驗組體長增長(0.37±0.17)cm、體質量增長(1.88±0.50)g高于對照組體長增長(0.23±0.10)cm、體質量增長(1.57±0.09)g且相比于對照組的投飼系數(shù)(1.78±0.12)，添加賴氨酸芽孢桿菌的試驗組(投飼系數(shù)：1.47±0.45)能有效降低0.31。

表1 凡納濱對蝦的體質量(體長)、存活率及投飼系數(shù)

2.2 賴氨酸芽孢桿菌對水體理化因子的影響

圖2 芽孢桿菌對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水樣的含量的影響

圖3 賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水樣的含量的影響

圖4 賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水樣的含量的影響

2.2.4 賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水樣的pH的影響

圖5 賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體的pH的影響

3 討論

3.1 賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦生長存活的影響

本試驗中，添加賴氨酸芽孢桿菌試驗組中凡納濱對蝦的體質量(體長)增長和投飼系數(shù)降低較對照組有差異不顯著，其中試驗組(A組、C組)投飼系數(shù)均低于對照組且試驗組存活率顯著高于對照組，這與李軍亮等[18]的研究結果中相似的是添加枯草芽孢桿菌可提高凡納濱對蝦的生長性能和降低餌料系數(shù)，與劉強強等[15]的添加芽孢桿菌對凡納濱對蝦的增重率有不同程度上的提高但差異不顯著以及飼料系數(shù)低于對照組的研究結果初步一致。這與芽孢桿菌的特性有關：1)芽孢桿菌能有效促進養(yǎng)殖對象腸道發(fā)育，增加腸黏膜的厚度、腸絨毛的高度及細胞密度，其表面抗原或代謝物擔當免疫原不斷刺激凡納濱對蝦的免疫防御系統(tǒng)，同時芽孢桿菌通過與有害細菌爭奪營養(yǎng)和附著位點，保護機體免受病原菌的侵染，提高存活率[19-22]；2)芽孢桿菌對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體具有較好的凈化的作用，給予養(yǎng)殖對象較好的生長環(huán)境條件[23-24]。

3.2 賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體的銨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮含量的影響

3.3 賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體的pH的影響

在養(yǎng)殖凡納濱對蝦的過程，凡納濱對蝦的排泄物和未完全利用的餌料等有機氮硝化過程以及芽孢桿菌以養(yǎng)殖水體中的有機物質作為碳源進行有氧呼吸，產(chǎn)生CO2[29]，都會致使水體中的pH逐漸下降，但賴氨酸芽孢桿菌的同化作用通過結合銨態(tài)氮和硝酸鹽氮合成自身所需的影響[28]，促使試驗組的養(yǎng)殖水體的pH相對于對照組下降速度更緩慢且會進行調(diào)控pH，試驗組平均pH達到7.35，最低值為7.09，這與白利丹研究報告中結果相似[30]，若使pH維持在理想的范圍，可以通過持續(xù)增加磷鈣物或有益微生物濃度調(diào)節(jié)pH[31]。

3.4 賴氨酸芽孢桿菌的使用存在問題及解決方法

芽孢桿菌的代謝和生長容易受到環(huán)境等外界因素的變化而波動，此次試驗中，賴氨酸芽孢桿菌菌液直接潑灑到養(yǎng)殖水體，而水體中的其他菌群可能對其代謝和生長有影響；再者養(yǎng)殖動物體質量大小不一，各個生長階段的營養(yǎng)需求及適應條件不同[10]，水環(huán)境因素，在養(yǎng)殖過程中滋生大量細菌對試驗的影響等等，無法控制使用最適菌液濃度，導致效果不理想。解決方法：在有限的條件下，盡量控制變量因素，挑選規(guī)格大小相同對蝦，科學高效的養(yǎng)殖管理方式，進行多次檢查試驗桶，盡可能地將死蝦撈出計數(shù)，避免污染水質，減小試驗數(shù)據(jù)差異。在實際應用中，要想賴氨酸芽孢桿菌投入養(yǎng)殖水體后起到改善水質的作用，需確保水體中活菌體濃度，才會有較好的效果[32]。

4 結論

通過持續(xù)添加賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦的生長和水質初步研究表明，賴氨酸芽孢桿菌對凡納濱對蝦的生長和存活有一定的作用，同時對于養(yǎng)殖水質中的銨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、pH具有顯著性的調(diào)控。賴氨酸芽孢桿菌是一種有益菌，利于養(yǎng)殖行業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展，可以推廣使用。

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