pH急性脅迫對方斑東風螺行為及免疫酶活性的影響

丁瑞霞，黃星美，趙 旺，鄧正華，陳恒大，溫為庚，馬振華，王江勇,鄭忠明

(1 天津農學院水產學院，天津 300384；2 三亞熱帶水產研究院，海南 三亞 572426；3 海南省深遠海漁業資源高效利用與加工重點實驗室，海南三亞，572426;4 中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣東 廣州 510300；5 惠州學院生命科學學院，廣東 惠州 516007;6 寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315822)

方斑東風螺(Babylonia areolata)俗稱香螺、花螺，屬于腹足綱，蛾螺科，主要生長在中國東南亞和日本沿海，是熱帶和亞熱帶的海洋物種，也是中國東南沿海主要的養殖產品和經濟貝類[1]。其營養豐富、肉質鮮美，是一種傳統海味，深受人們的喜愛，市場容量較大。近年來，隨著苗種繁育及養殖技術的突破與升級，方斑東風螺工業化養殖在中國東南沿海地區發展迅速[2]。

水環境在水生生物的生長繁殖中起著重要作用，而不適宜的環境則會抑制水生生物的發育、生長和繁殖。pH是水產養殖水環境的重要指標，過高、過低都會直接影響水產養殖生物的生長、攝食和代謝[3-4]。在貝類工業化的養殖過程中，大量的貝類死亡、藻類的過度喂養甚至海水的紅潮都會降低水體的pH，而且在養殖過程中，為了凈化水質，栽植大量的水生植物，由于光合作用，水中的二氧化碳(CO2)被大量消耗，導致水體pH增加[5]，pH的變化會對水生生物造成慢性或急性的應激，影響其活動及免疫功能[6-10]。方斑東風螺在中國南方沿海的養殖方式主要以露天陸地水泥池的流水養殖為主，水產養殖池pH的變化會對其生理和生長過程產生不同影響。酸性和堿性環境會降低幼貝的附著力，兩殼緊密閉合、觸手不伸出[11]。

本研究通過pH脅迫試驗確定了方斑東風螺免疫活性的變化，更好地了解方斑東風螺的免疫反應，為深入研究方斑東風螺提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

據試驗要求放入健康、大小均勻且活力強的方斑東風螺，觀察活動和生存情況，試驗過程中觀察24 h內百分百死亡pH(LC100/24 h)和96 h內百分百無死亡pH(LC100/96 h)，據試驗結果確定試驗液pH的上、下限，然后用等間距方法分別設置了5.0～9.0等5個pH濃度梯度，利用氫氧化鈉(NaOH)或者氯化氫(HCl)來調節至相應pH，使用pH分析儀測定相應的pH，并將已經配置好的海水儲存在單獨的水箱中。以自然海水pH=8.0為基礎，用pH分析儀對水體的pH每天早晚各矯正一次，控制pH日變化幅度不超±0.2。每組處理均為3個平衡，并將30只健康活躍的螺放在每個實驗容器(40 L)中。試驗用螺質量相近，來降低試驗差異性，整個試驗過程中螺不會重復使用，并在試驗期間停止投喂。

試驗開始后，從6、12、24、48、72和96 h內隨機選擇每組3只方斑東風螺，檢測每種免疫酶的活性。在這種情況下，每6 h從每個容器中取出水樣，測量pH并及時調整到預定值。在試驗中，對各試驗組方斑東風螺的活動狀況和死亡率進行持續觀察和記錄，評估死亡的標準是，螺肉向外翻，吻管向外突出，發白僵硬。

1.2.2 樣品的處理

用0.2 mol/L的生理鹽水以1∶2 的質量體積比研磨整個組織，將研磨液置于5 000 r/min、4 ℃下離心10 min，并將上清液置于潔凈的EP(eppendorf)管中，-80 ℃冰箱內保存、備用，POD、CAT、ACP和GSH-PX活性的測定分別采用相關試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2.3 試驗數據的處理分析

獲得的數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示，并使用SPSS 21.0 對試驗結果進行統計學分析。先對數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，若處理間有顯著性差異，再用Duncan法對均值進行比較，顯著性水平為P<0.05，極顯著性水平為P<0.01。

2 結果

2.1 pH脅迫對方斑東風螺的行為及存活率的影響

在pH試驗組中，隨著pH的改變，方斑東風螺出現不同程度的應激反應。pH脅迫后，方斑東風螺主要表現為對外部刺激反應遲鈍，運動緩慢，爬壁運動減少，沉到桶底，無法正立，身體硬死。方斑東風螺的死亡狀態為發白僵硬，螺肉外翻，吻管向外伸出。pH=5.0的試驗組在6 h時出現了行動緩慢、翻背，在72 h開始死亡，死亡率為13%。pH=9.0試驗組在12 h出現翻背，其翻背率為50%至27 h出現死亡。其他pH試驗組的方斑東風螺生活狀況良好，存活率100%，僅有個別螺出現翻背的現象(見表1)。隨著時間的推移，對照組的方斑東風螺也從最初的行動活躍到最后的行動緩慢、翻背。

表1 pH脅迫下方斑東風螺的行為和存活率影響

2.2 pH脅迫對方斑東風螺GSH-PX活性的影響

pH脅迫對方斑東風螺GSH-PX活性的影響如圖1a所示。可以看出，不同pH的處理時間對方斑東風螺GSH-PX活力影響顯著(P<0.05)，不同pH下GSH-PX活性短時間內無顯著性差異(P>0.05)。在pH=5.0時，GSH-PX的活性先升高后又降低，并在48 h活性達到7.48 U/mgprot的峰值。同樣的pH=8.0時，GSH-PX活性在6 h也達到了最大值9.44 U/mgprot。然而，GSH-PX活性在其他各試驗組中隨著時間的推移，GSH-PX顯示出“誘導-抑制”的趨勢。

2.3 pH脅迫對方斑東風螺CAT活性的影響

pH脅迫對方斑東風螺CAT活性的影響如圖1b所示。可以看出，不同pH的處理時間對方斑東風螺CAT活力影響顯著(P<0.05)，不同pH下CAT活性短時間內無顯著性差異(P>0.05)。在pH=9.0時，CAT活性變化顯著，在12 h試驗組活性出現峰值，達到58.26 U/mgprot，隨著時間的推移，活性逐漸降低；在pH=7.0時，試驗組在6 h活性達到最低值15.23 U/mgprot。總體來看，隨著時間的不斷延長，各pH處理組CAT活性顯示出 “誘導-抑制-誘導”的變化趨勢。

2.4 pH脅迫對方斑東風螺POD活性的影響

pH脅迫對方斑東風螺POD活性的影響如圖1c所示。可以看出，不同pH的處理時間對方斑東風螺POD活力影響顯著(P<0.05)，不同pH下POD的活性短時間內無顯著性差異(P>0.05)。當pH=7.0、8.0時，POD活力呈現先降低后升高最后降低的趨勢，其他實驗組POD活力均呈現為先升高后降低的趨勢。當pH=9.0時，POD活力變化顯著，在24 h活力出現峰值，達到15.19 U/mgprot，當pH=5.0時，試驗組POD活力在96 h達到最低值，活力為5.03 U/mgprot。雖然各試驗組POD活力的變化規律不同，總體看來，POD活性顯示出“誘導-抑制”的變化趨勢。

2.5 pH脅迫對方斑東風螺ACP活性的影響

pH脅迫對方斑東風螺ACP活性水平的主要影響如圖1d所示。可以看出，不同pH的處理時間對方斑東風螺ACP活力影響顯著(P<0.05)，當pH=5.0、8.0、9.0時，ACP的活性顯著上升，并可于12 h達到最高，但隨著時間的推移，ACP的活性逐漸出現抑制。pH=7.0時，ACP活性由6 h的最高值173.09 U/mgprot逐漸降低，后雖然隨著時間的變化有所提高，但總體ACP活性仍然是受到抑制。pH=6.0時，ACP活性受到輕微抑制后隨時間顯著升高，在24 h時后又呈現抑制的現象。因此，低pH處理組(pH=5.0、6.0)ACP活性顯示出“誘導-抑制”的變化趨勢。

圖1 pH脅迫對方斑東風螺免疫酶活性水平的主要影響

3 討論

3.1 pH對方斑東風螺行為和存活率的影響

在適宜的環境條件下，水生生物體內的代謝會加強，有利于其生長發育。反之，會對水生生物產生代謝壓力進而影響其生長[12-13]。pH作為一個重要的環境因子，其變化可能會導致水生生物的免疫能力受損甚至死亡[14]。本試驗中，在pH為5.0、9.0處理72 h時的平均死亡率超過10%，在96 h的死亡率達到20%。試驗發現，方斑東風螺的最適pH為8.0，其最高和最低的臨界pH分別為9.0和5.0，超出這個臨界范圍，方斑東風螺的存活率會大大降低。這和劉洋等[15]的研究結果相似，不同pH對海灣扇貝(Argopectenirradians)胚胎發育的影響，隨著pH的降低，存活率逐漸下降。水體pH會直接地影響水生生物代謝功能，造成其免疫系統受損、酸堿平衡紊亂、導致個體的死亡。覃玉蓮等[16]研究低pH對小龍蝦(Procambarusclarkia)免疫功能影響時發現，在低pH水環境條件下，時間越長，死亡率也就越高，這是因為小龍蝦長期的處于酸性條件下，破壞了小龍蝦的免疫系統從而影響小龍蝦自身的修復功能，使其無法有效抵御疾病。本研究中，隨著時間的延長，方斑東風螺在過高、過低pH下，死亡率都逐漸上升，這可能因為pH破壞了方斑東風螺的免疫系統，使其失去抵御外來病原體入侵的能力而死亡。

有研究表明，水生生物可以通過體內緩沖系統調節滲透壓，使體內pH接近中性，維持機體酸堿平衡，使其能適應一定范圍內外界pH的變化，但是，如果超過緩沖限值，機體的pH會發生顯著變化，破壞體液的酸堿平衡，影響機體正常生理活動[17-18]。本研究結果表明，方斑東風螺對于pH有著一定程度的耐受性，因此在短時間內，pH過高或者過低，方斑東風螺僅僅表現出翻背，運動遲緩，并沒有立即死亡，并且這與李健等[19]研究結果相似，pH脅迫對中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)死亡率有一定的影響，高和低pH脅迫都會使3種對蝦的存活率隨時間的延長而逐漸降低。梁從飛等[20]研究表明，pH升高會導致羅非魚(Oreochromismossambicus)血清滲透壓發生顯著變化，從而破壞魚類體內的酸堿平衡，對羅非魚造成危害。本研究中方斑東風螺在高、低pH條件下均會出現翻背，這是因為在pH突變環境中方斑東風螺采取主動調節措施，維持體內離子和酸堿平衡，這既是機體的被動病理表現，也是主動的保護反應[21]，這跟榮小軍等[22]研究的不適pH下海參(Holothuria)會出現身體蜷曲、棘刺收縮，糞便變細變短相類似。

3.2 pH對方斑東風螺個體免疫酶活性的影響

CAT和POD是動物體內重要的抗氧化酶，GSH-PX可以將過氧化氫(H2O2)分解成氫氣(H2)和氧氣(O2)，來有效阻止體內膜脂質細胞的過氧化，進而有效減緩膜細胞因氧化和應激而引起細胞的破壞。正常的狀態條件下，CAT和POD可以與GSH-PX聯合作用清除動物基體內存在的過氧反應性自由基，使得動物基細胞體內的自由基化合物的氧化形成過程和氧化消除過程達到一個動態的平衡，從而可以保證使其自身免遭有害自由基化合物的破壞[23-25]。研究發現，CAT和POD的活性越強，抗逆性也就越強，其消除自由基能力也越強。而當動物的生存環境發生變化，受到脅迫時，這兩種酶的活性就會發生應激變化以適應新的環境[26-27]。該研究中，方斑東風螺受到pH脅迫CAT和POD的酶活性在短時間內顯著上升，隨著時間的延長這兩種酶的活性又逐漸降低。這可能是因為方斑東風螺體內的CAT和POD產生適應環境的誘導反應，因此提高了這兩種酶的活性，使其達到新的動態平衡。然而，隨著時間不斷延長，由于方斑東風螺初始產生的活性氧超過了其抗氧化系統的捕獲能力，抗氧化系統無法及時捕捉自由基，從而導致氧化損傷，使得CAT和POD活性均降低或者喪失。GSH-PX具備單獨去除過氧化物的能力，隨時間延長，GSH-PX逐漸適應新的pH環境，當生物受到脅迫，體內脂質過氧化時，GSH-PX活性就會升高進而去清除體內的過氧化物。田立立[5]在研究pH脅迫克氏原螯蝦(Pro-cambarusclarkii)時也發現，GSH-PX活性受到pH脅迫在短時間內迅速下降，而后又隨著適應新環境而升高。這也與劉鵬飛等[28]研究凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)CAT和POD基因表達的機理相似。

ACP是參與動物免疫防御功能的主要水解酶，它也是吞噬細胞的主要成分[29]，主要來源于粒細胞顆粒，在細胞吞噬作用、鈣磷代謝、體內蛋白質合成和磷酸基團轉移等過程起重要作用[30]，它的活力變化是判斷水產動物免疫力的重要指標[31-34]，因此在動物免疫學中ACP作為關鍵的免疫指標，長期以來一直被廣泛研究。Suresh等[35]研究了銅離子(Cu2+)脅迫下貝類血細胞ACP活性變化，發現在低或者高pH脅迫下，ACP活性明顯升高。本研究中，較低和較高pH條件下，方斑東風螺的ACP酶活性的變化也趨于相同，均是呈先緩慢上升后逐漸下降的態勢，這是由于方斑東風螺處于pH變化的環境中，為維持自身體內酸堿平衡而采取的主動調節措施，也是一種被動的病理表現。當環境因子存在脅迫時，方斑東風螺的免疫功能將出現暫時的增強。也就是說，ACP活力提高是機體在病理條件下急性激活反應中免疫功能的表現，提高活性有助于保護機體并減少氧化損傷。這跟樊甄嬌等[36]研究結果一致，pH對櫛孔扇貝(Azumapectenfarreri)ACP活性都有明顯的影響，隨著pH急劇變化，ACP活性明顯升高。當貝類受到損傷時，為防止外來病原生物入侵，激活溶酶體中以ACP為主的一系列水解酶，使這些酶活力大大提高[37-38]。由此看來，除了作為自身防御的反應外，ACP活力升高也被認為是一種被動病理表現。

4 結論

研究表明，pH對方斑東風螺免疫酶活性有顯著影響，高pH和低pH水體養殖一段時間之后，都會表現出不能保持正立、腹面朝上、運動緩慢等狀態，甚至還會導致方斑東風螺死亡。當受到重度pH脅迫時，方斑東風螺的GSH-PX、CAT、POD、ACP活性被抑制；當受到輕度pH脅迫時，免疫酶活性則被誘導。試驗結果顯示，在pH改變時，這些免疫酶活性變化得較特異，與方斑東風螺所處的發育階段不同、抗逆能力較強、免疫能力強等生物習性有關。pH處理組中方斑東風螺免疫酶活力變化規律，很好地指引了養殖水體pH調控范圍。未來對東風螺的進一步研究將考慮方斑東風螺對不同環境脅迫反應的種內變異性，以及種間差異性。

□