基于中國人Lynch 綜合征臨床標準的家族性結直腸癌胚系突變譜多中心研究*

楊夢園 朱麗珍 張鼎 吳斌 顧艷宏 吳濤 張敬東 邱萌 潘杰 袁瑛

約1/3 的結直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者有腫瘤家族史，但是目前僅5%左右結直腸癌可檢測出胚系致病性突變，即確診為遺傳性結直腸癌，其中以Lynch 綜合征最為常見。Lynch 綜合征是一種常染色體顯性遺傳的惡性腫瘤綜合征，表現為罹患結直腸癌、胃癌、子宮內膜癌、小腸癌、輸尿管或腎盂癌、卵巢癌和肝膽系統腫瘤等惡性腫瘤風險顯著增高，是由5 個DNA 錯配修復（mismatch repair，MMR）基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM）突變引起，以MMR 功能缺陷（deficient MMR，dMMR）為主要分子病理特征[1]。Lynch 綜合征的確診依賴于胚系致病突變的檢出，然而推薦所有結直腸癌患者接受Lynch綜合征相關胚系測序有悖于衛生經濟學目標，因此通常采用腫瘤家族史對結直腸癌患者進行初篩，再建議其中的高風險人群進行后續胚系檢測與遺傳咨詢。

目前國際上通用的Lynch 綜合征臨床診斷標準和臨床篩查標準分別為Amsterdam Ⅱ標準和改良的Bethesda 標準[2]。然而，國際上的通用標準并不適合規模日益小型化的家庭。基于Yuan 等[3]的研究成果和中國家系特點，2003 年全國遺傳性大腸癌協作組提出中國人Lynch 綜合征臨床標準[4]：家系中至少有2例組織病理學明確診斷的CRC 患者，其中2 例為父母與子女或同胞兄弟姐妹的關系（一級血緣親屬），且符合以下任一條件：1）至少1 例為多發性CRC 患者（包括腺瘤）；2）至少1 例CRC 發病年齡＜50 歲；3）家系中至少1 例患Lynch 綜合征相關腸外惡性腫瘤（包括胃癌、子宮內膜癌、小腸癌、輸尿管和腎盂癌、卵巢癌和肝膽系統癌）。

根據既往研究報道，僅一半左右符合AmsterdamⅡ標準的家系和65%符合改良的Bethesda 標準的微衛星高度不穩定（microsatellite instability-high，MSI-H）家系能檢測出MMR 基因突變[5-6]。而符合中國人Lynch 綜合征臨床標準的患者中近30%可最終確診為Lynch 綜合征[3,7]。但是，這些中國人Lynch 綜合征臨床標準相關研究大多開展于2000 年左右，當時仍采用一代測序作為主要的基因檢測手段。如今，二代測序技術在臨床中的應用日益廣泛，實現了利用有限的生物樣本，高通量、高效率檢測多個基因，也為Lynch 綜合征的臨床診治帶來了新的契機。因此，前期本課題組開展了一項基于中國人Lynch 綜合征臨床標準的人群研究，利用一個包含61 個已報道與遺傳性消化道腫瘤相關基因的二代測序平臺，對入組患者進行胚系突變檢測，旨在獲得二代測序時代下符合中國人Lynch 綜合征臨床標準的家族性CRC 患者最終確診Lynch 綜合征的比例，同時建立起中國人群的家族性CRC 胚系突變譜。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 基于中國抗癌協會大腸癌專委會遺傳學組和中國醫師協會結直腸腫瘤專業委員會遺傳專委會平臺，本課題組織了一項按照中國人Lynch 綜合征臨床標準使用二代測序平臺診斷Lynch 綜合征的開放性、多中心研究（Clinicaltrials.gov 注冊號：NCT03046849），共收集了85 例就診于國內7 家醫院（浙江大學醫學院附屬第二醫院、北京協和醫院、江蘇省人民醫院、北京大學第一醫院、遼寧省腫瘤醫院、四川大學華西醫院和溫州市中心醫院）符合中國Lynch 綜合征臨床標準的CRC 患者的臨床信息，并對其進行外周血采集。這85 例患者相互間無血緣關系。此外，對于同意提供其他家系成員樣本的家系，同時采集這些家系成員的外周血、唾液等樣本。每位提供樣本及臨床信息的患者和家系成員均同意并簽署《遺傳性結直腸癌胚系突變研究知情同意書》。本研究經浙江大學醫學院附屬第二醫院倫理委員會審核同意后實施（倫理批準號：2017-011）。

1.1.2 提取研究對象基因組DNA 應用 DNeasy Blood &Tissue Kit（69506，Qiagen 公司，美國），由QIAcube 核酸自動提取儀（Qiagen 公司，美國）完成患者及家系成員的外周血DNA 提取。應用口腔拭子DNA 提取試劑盒（天根公司，中國北京）提取家系成員的唾液DNA。應用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（56404，Qiagen 公司，美國）試劑盒提取石蠟包埋的腫瘤組織DNA。

1.2 方法

1.2.1 二代測序 采用深圳華大基因股份有限公司的BGISEQ500 遺傳性腫瘤組件（深圳華大基因股份有限公司，中國），檢測61 個與遺傳性消化道腫瘤相關的基因：APC，ATM，AXIN2，BARD1，BMPR1A，BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDC73，CDH1，CDK4，CDKN1B，CDKN2A，CHEK2，EPCAM，EXT1，EXT2，FH，FLCN，MAX，MEN1，MET，MLH1，MLH3，MRE11A，MSH2，MSH6，MUTYH，NBN，NF1，NF2，NTRK1，PALB2，PMS1，PMS2，PTEN，RAD50，RAD51C，RB1，RET，SDHAF2，SDHB，SDHC，SDHD，SMAD4，STK11，TMEM127，TP53，VHL，RAD51D，SMARCA4，HOXB13，BLM，GALNT12，MSH3，NTHL1，POLD1，POLE，KIT，PDGFRA，SDHA。通過構建相應二代測序文庫、上機測序（BGISEQ500 測序儀，深圳華大基因股份有限公司，中國），對每個基因外顯子及其鄰近±10 個堿基的內含子區變異（包括點突變和20 個堿基以內的缺失插入突變）、拷貝數變異情況進行分析。根據相對于人群數據庫（千人基因組數據庫和 ExAC 數據庫）數據和本地數據集確定的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF），保留MAF 小于0.1%的突變。根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（American college of medical genetics and genomics，ACMG）指南對胚系變異進行分類，包括良性、疑似良性、臨床意義不明、疑似致病和已知致病五類[8]。

1.2.2 多重熒光多聚酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）毛細管電泳法 構建PCR 擴增體系，5個微衛星位點對應PCR 引物如下：NR-21（F：GAGT CGCTGGCACAGTTCTA；R：CTGGTCACTCGCGT TTACAA）、NR-22（F：GGATAATCGAGGCTTGTCA AG；R：GCCCAAGACAAAACTTCCAG）、NR-24（F：GTGTCTTGCTGAATTTTACCTCCTGAC；R：ATTG TGCCATTGCATTCCAA）、BAT-25（F：CTCGCCTCC AAGAATGTAAGT；R：TCTGCATTTTAACTATGG CTC）和BAT-26（F：CTGCGGTAATCAAGTTTTTA G；R：AACCATTCAACATTTTTAACCC）；3730XL測序分析設備（ABI 公司，美國）檢測PCR 產物；Genemapper 軟件分析短核苷酸重復數據。

1.3 統計學分析

使用R 軟件（版本3.6.2）（https://www.r-project.org/）完成突變譜繪制，應用SnapGene、GeneMapper 軟件進行突變信息分析。

2 結果

2.1 遺傳性腫瘤相關基因的已知致病性或疑似致病性胚系突變

85 例符合中國人Lynch 綜合征臨床標準的家族性CRC 患者，經二代測序平臺所檢測到的3 級及以上的突變，即臨床意義不明、疑似致病和已知致病突變見圖1。其中，24 例（28.2%）患者攜帶MMR 基因已知致病性或疑似致病性胚系突變，即可確診為Lynch 綜合征，具體包括17 例MLH1相關Lynch 綜合征、6 例MSH2相關Lynch 綜合征以及1 例由于EPCAM基因第8～9 號外顯子大片段缺失而導致的Lynch 綜合征（上述Lynch 綜合征患者胚系致病突變信息見表1）。

圖1 85 例入組患者胚系突變情況（僅包括已知致病性、疑似致病性和臨床意義不明突變）

表1 攜帶Lynch 綜合征相關基因的已知致病或疑似致病突變的CRC 患者信息

表1 攜帶Lynch 綜合征相關基因的已知致病或疑似致病突變的CRC 患者信息 （續表1）

另外，本研究還檢測到具有CRC 和肝癌家族史的第34 號直腸癌患者攜帶MUTYH基因c.467G＞A雜合性無義突變，而未檢測到其他突變。雖然MUTYH相關息肉病是一種常染色體隱性遺傳病，但是該基因單等位基因突變可以增加CRC 患病風險[9]。該突變導致MUTYH基因編碼蛋白在第156 位發生提前終止，造成其多肽鏈截短，而正常的MUTYH基因可編碼549 個氨基酸。Guan 等[10]在1 例CRC 患者中檢測到MUTYHp.Trp156Ter 突變，故判定該變異為已知致病突變。第76 號先證者除MLH1基因無義突變外，還攜帶遺傳性癌癥易感綜合征相關基因RAD50基因[11,12]的移碼突變（c.2980_2983delAAAG；p.Glu995-Argfs*2）。而第18 號先證者除MLH1基因已知致病性錯義突變（c.199G＞A；p.Gly76Arg）外，還攜帶了遺傳性腎癌相關易感基因MET基因[13]的剪接體變異（NM_001 127500；c.2784+1G＞A）。

2.2 Lynch 綜合征相關基因臨床意義不明突變

共15 例（17.6%）患者攜帶臨床意義不明的Lynch綜合征相關基因（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）雜合突變，具體突變信息詳見表2。其中第40 號先證者攜帶MLH1基因c.2240_2255 delCTGATCTATACAAAGT 雜合性通讀突變，該突變可造成終止密碼子的改變，從而使得編碼蛋白無法在正常位置終止而繼續延伸翻譯；與普通的移碼突變不同，其并不會導致編碼蛋白截短，而是蛋白C 端延長。目前暫未發現與該變異有關的功能研究和臨床意義的文獻報道，且在千人基因組數據庫中的檢出頻率為0。不過，既往曾有兩個關于MLH1基因通讀突變的案例報道，分別報道MLH1c.2250_2251 ins AA（共編碼782 個氨基酸）[14]和c.2262_2263 delGA（共編碼788 個氨基酸）[15]，均被判讀為致病突變。為了明確MLH1基因c.2240_2255-delCTGATCTATACAAAGT 性質，本研究進行了家系驗證，該家系中有多人患結直腸癌、胃癌等Lynch綜合征相關惡性腫瘤，且家系中年齡最小的惡性腫瘤患者僅26 歲，符合Amsterdam Ⅱ標準；而此MLH1基因通讀突變在此高度懷疑Lynch 綜合征家系中存在顯著的家系共分離，家系驗證結果詳見圖2A。另外，本文采用多重熒光PCR 毛細管電泳法檢測了先證者腫瘤組織微衛星狀態，結果顯示5 個微衛星位點中3 個位點（NR-21、NR-24 和BAT-26）不穩定，故判讀為MSI-H，峰圖詳見圖2B。因此，本研究認為此變異可能是該家族性CRC 家系的關鍵致病原因，但是MLH1基因編碼蛋白的延長導致DNA 錯配修復系統功能缺陷的具體機制有待研究者進一步的探索。

表2 攜帶Lynch 綜合征相關基因的臨床意義不明突變的CRC 患者信息

表2 攜帶Lynch 綜合征相關基因的臨床意義不明突變的CRC 患者信息 （續表2）

圖2 第40 號先證者家族史和腫瘤組織微衛星狀態檢測結果

除第40 號家系外，其余14 個符合中國人Lynch綜合征臨床標準的CRC 家系均未達到Amsterdam Ⅱ標準，且MMR 蛋白表達或微衛星狀態均未提示存在錯配修復功能缺陷。因此，目前尚無法判斷上述變異與家族性CRC 的因果關系。

2.3 其他相關基因（MLH3、MSH3）的突變

本研究中共有9 例患者被檢測到攜帶MLH3或MSH3基因胚系突變（表3）。雖然第36 號先證者攜帶的是MLH3基因純合移碼突變，該變異可造成MLH3基因編碼蛋白截短，但是該患者腫瘤組織呈現錯配修復功能完整（proficient MMR，pMMR）且微衛星穩定（microsatellite stable，MSS），說明MLH3 蛋白對DNA 錯配修復系統影響甚微。另外前期本研究組通過一代測序進行家系驗證[16]，發現該變異無明確家系共分離，因此，目前尚缺乏足夠證據提示MLH3c.615delA 是家族性CRC 致病突變。

表3 攜帶MLH3 或MSH3 基因突變的CRC 患者信息

第54 號先證者同樣來自一個具有顯著腫瘤相關家族史的家系，家系圖譜詳見圖3。二代測序及實時熒光定量PCR 均提示該患者攜帶MLH3第2～11 號外顯子重復變異。然而，由于先證者的姐姐（Ⅲ-7）于43 歲時確診卵巢子宮內膜樣癌，且與先證者一樣，腫瘤組織免疫組織化學檢測結果顯示MSH2 和MSH6蛋白表達缺失，但未攜帶該重復變異。因此，認為該MLH3重復變異與該家系的腫瘤家族史無直接聯系。而后，對這個家系多名成員（Ⅲ-6、Ⅲ-7；父系Ⅱ-4、Ⅲ-3；母系Ⅱ-9、Ⅲ-12）的胚系基因組DNA 以及Ⅲ-7 患者腫瘤組織DNA 進行了全外顯子檢測。無論是父系還是母系，均未篩選出Ⅲ-6、Ⅲ-7 與父系或母系中患者所共有且健康人未攜帶的致病或疑似致病突變。另外，本研究發現Ⅲ-7 的腫瘤組織同時存在MSH2移碼突變（NM_000251.2；c.2205_2209delCCTCA；p.I735fs）和第8 外顯子拷貝數異常，不排除Ⅲ-7 腫瘤組織免疫組織化學檢測的dMMR 來自MSH2基因的雙等位基因體細胞突變。

圖3 第54 號患者家系圖譜

前文已提及的第40 號先證者，除攜帶MLH1基因c.2240_2 255 delCTGATCTATACAAAGT 通讀突變外，同時檢出MSH3基因c.2731T＞G 錯義突變，但是綜合比較兩種變異，本研究認為MLH1通讀變異對DNA 錯配修復系統的影響相對更大。

3 討論

本研究共入組了85 例符合中國人Lynch 綜合征臨床標準的家族性CRC 患者，采用二代測序平臺共確診24 例（28.2%）Lynch 綜合征，即檢測到明確的致病性胚系突變。該確診率與既往利用一代測序的研究（確診率為23.0%～29.4%）[3,7,17]相比，顯示二代測序雖能顯著提升Lynch 綜合征檢測效率，但并不會提高其確診率。近年來，國內也有數項利用二代測序平臺進行Lynch 綜合征篩查的研究[18,19]，報道了中國人群的Lynch 綜合征臨床病理特征、突變譜等信息，但上述研究均以免疫組織化學染色提示dMMR 的CRC 患者作為篩查對象。本研究是目前國內首個以符合中國人Lynch 綜合征臨床標準的家族性CRC 患者作為研究對象，并采用二代測序平臺描繪中國人群家族性CRC 胚系突變譜的多中心研究。

另外，15 例（17.6%）患者攜帶Lynch 綜合征相關基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM）臨床意義不明的胚系突變，其中11 例（73.3%）突變為錯義突變。如果要明確這些突變與家族性CRC 的關系，對血緣親屬樣本進行家系驗證是重要的一個環節。此外，MMR 基因錯義突變對于DNA 錯配修復系統功能的影響檢測也是主要證據之一。有研究[20-21]發展一種無細胞體外MMR 活性檢測技術（cell freein vitroMMR activity，CIMRA），用于評估MMR 基因突變是否影響錯配修復功能，MMR 錯義突變檢測正確率達65%，CIMRA 技術聯合數據模型后能將這一數值提高到87%。通過這項技術，Lynch 綜合征相關基因意義不明的突變是否致病可得到進一步解釋。

本研究中9 例患者檢測出MLH3及MSH3胚系突變，然而這兩個基因是否為遺傳性CRC 致病基因仍存在較大爭議。MLH3 蛋白是DNA 錯配修復基因的MutL 同源（MutL homolog，MLH）家族的成員之一，而MSH3 蛋白與MSH2 異源二聚化以形成MutSβ 二聚體，參與DNA 錯配修復[22-23]。但是研究顯示MLH3和MSH3 蛋白對于DNA 錯配修復的貢獻非常有限，多個可能與遺傳性CRC 相關的MLH3基因突變被認為既不影響蛋白表達水平，也不影響其功能[24,25]。一項研究稱MLH3c.3563C＞G p.Ser1188Ter 可能是遺傳性息肉病的致病原因[26]。然而本研究中的第36 號和第54 號患者分別攜帶MLH3c.615delA 純合突變和第2～11 外顯子重復變異，通過家系驗證等變異分析手段，認為尚缺乏充足證據證明MLH3基因在遺傳性CRC 中的致病意義。

此外，二代測序的高速發展除可以實現利用較少的生物樣本以檢測更多的基因以外，也會帶來大量臨床意義不明的突變；還有一部分患者和（或）其血緣親屬的癥狀是某些遺傳性腫瘤綜合征的典型臨床表型，但通過常規的基因檢測手段未能發現相關基因的突變。以上兩個現象均會給臨床醫師和患者及其親屬帶來巨大的困惑，如何去甄別、判讀、尋找真正的發病原因是一個亟待解決的難題。首先，強烈建議盡可能多的血緣親屬提供樣本和臨床信息，尤其是患腫瘤的血緣親屬和年齡較大的未患惡性腫瘤的血緣親屬形成對照，協助判斷突變是否存在家系共分離。其次，面對臨床表型典型但致病突變未明的患者，需要考慮到檢測方法的局限性，可以選擇檢測范圍更廣的手段，如全外顯子測序或全基因組測序等方法，除尋找其他基因的致病變異以外，同時可以檢測已知關鍵基因是否發生拷貝數變異、5’UTR、啟動子區和3’UTR 等一些容易被遺漏的突變。

本研究通過二代測序平臺檢測符合中國人Lynch綜合征臨床標準的家族性CRC 患者中最終確診為Lynch 綜合征的比例，確診率與既往一致，但同時發現存在較多Lynch 綜合征相關基因意義不明的突變；家系驗證和腫瘤組織DNA 錯配修復系統檢測（MMR 蛋白表達水平或微衛星狀態）是目前最有效的方法，可以幫助判斷基因突變是否與疾病直接相關。另外，需要謹慎對待尚未明確的基因突變檢測結果，并認識到所用檢測方法的局限性，必要時進行更深入的家系研究和更全面的分子檢測。