表沒食子兒茶素沒食子酸酯對丙泊酚誘發老年大鼠認知功能損傷的影響

劉文雄，高 敏

陜西省西安市西電集團醫院麻醉科，陜西西安710077

丙泊酚是目前臨床應用最為廣泛的快速、強效全身麻醉劑，具有藥效快速、麻醉平穩、蘇醒快速等優點[1]。在臨床上，丙泊酚以首次相對較高的劑量給藥使患者失去意識，然后以較小的劑量連續輸注，以保持患者無反應的鎮靜狀態。但是丙泊酚具有一些藥物不良反應，尤其是對神經系統的認知功能損傷最為突出[2]。研究發現，丙泊酚注射能夠引起患者產生不同程度的認知功能損傷，其中以對兒童和老年人的認知功能損傷更為明顯[3-4]。但是，目前臨床上尚缺乏應對丙泊酚誘發的認知功能損傷的安全、有效的防治方法。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是一種抗炎和抗氧化劑多酚，主要存在于綠茶中。研究發現，EGCG對癌癥、肥胖、高血糖、動脈粥樣硬化和神經退行性疾病具有積極的治療作用[5-6]。流行病學調查也證實了長期服用低劑量EGCG的生物安全性[7]。但是，目前國內外關于EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷的影響及機制報道較少。本研究通過構建丙泊酚誘發的老年認知功能損傷大鼠模型，研究EGCG對該大鼠模型認知功能損傷的潛在治療效果并探討相關的作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 Morris水迷宮購自上海移數信息科技有限公司；病理切片機(型號RM2016)購自德國徠卡公司；激光掃描共聚焦顯微鏡(型號FV1200)購自日本奧林巴斯公司；雙垂直電泳儀(型號DYCZ-24DN)購自北京六一儀器廠；酶標檢測儀(型號Rt2100c)購自美國Rayto公司；凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司；半干轉膜儀(型號Trans-Blot SD System)購自美國Bio-Rad公司；丙泊酚注射液購自西安立邦制藥有限公司；EGCG購自美國Apexbio公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、核因子κB(NF-κB)p65、磷酸化p65(p-p65)和GAPDH抗體購自美國Abcam公司；原位末端標記(TUNEL)凋亡熒光檢測試劑盒購自美國Abcam公司。

1.2分組處理 36只雄性20月齡SPF級Sprague-Dawley大鼠，體質量405～430 g，購自成都達碩實驗動物有限公司。全部實驗動物隨機等分為對照組、丙泊酚組和丙泊酚+EGCG組，每組12只。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水(5 mL/d)，丙泊酚組和丙泊酚+EGCG組腹腔注射丙泊酚60 mg/kg，每小時注射1次丙泊酚(注射劑量為首次劑量的一半)，維持麻醉6 h。每次麻醉后立即躺在自制的吸氧箱上，以5 L/min的流量持續供氧，待翻正反射恢復后，將大鼠從吸氧箱中取出。除實驗時間外，大鼠可以自由進食和飲水。丙泊酚+EGCG組大鼠每天進行50 mg/kg的EGCG灌胃處理，連續治療7 d。對照組和丙泊酚組的大鼠每天給予相同體積的生理鹽水灌胃處理。

1.3Morris水迷宮實驗 7 d的治療結束后，采用Morris水迷宮實驗評價3組大鼠的學習記憶能力。測試前，將平臺放置在水迷宮東北象限的中心，高度在水面以下2 cm處。在池子里加入適量的墨水，使動物無法分辨平臺。游泳池的墻上掛著幾個物體作為參考。將水溫加熱至24～26 ℃，進行定位導航試驗5 d。每天分為2個時段，每時段4次訓練。在4次訓練中，將大鼠分別置于不同象限的水中，用秒表記錄大鼠找到平臺前的持續時間(逃逸潛伏期)。兩次訓練間隔1 min。第5日下午進行探索實驗。平臺被移走，動物們被從西南象限放入水中，使用攝像機記錄大鼠在迷宮里2 min內的游泳距離和穿越平臺次數。

1.4大鼠海馬組織炎癥因子和神經營養因子水平檢測 Morris水迷宮實驗結束后，立即使用過量戊巴比妥鈉腹腔注射處死各組大鼠。隨后，對大鼠開顱提取海馬組織，將海馬組織等分為3份，分別用于ELISA、組織切片染色和蛋白質印跡法(Western blot)檢測。使用生理鹽水(1∶10)快速制備勻漿，3 000 r/min離心10 min，獲得上清液。采用ELISA試劑盒檢測海馬組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、神經生長因子(NGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)水平。全過程嚴格按照試劑盒中說明書操作步驟執行。

1.5大鼠海馬組織TUNEL熒光染色 對提取的大鼠海馬組織進行4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，病理切片機下進行組織切片，二甲苯和梯度酒精中脫蠟。采用TUNEL工作液將組織切片進行孵育，37 ℃避光1 h，隨后采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚復染，37 ℃避光1 h，封片后在激光共聚焦顯微鏡下進行圖像采集和數據分析。

1.6大鼠海馬組織蛋白的Western blot檢測 將大鼠海馬組織在玻璃研磨機中充分研磨，隨后加入1 mL細胞裂解液裂解30 min，然后以2 000 r/min離心5 min，獲取上清液，使用BCA法對蛋白水平進行測定。隨后以4∶1比例上樣，煮沸后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜及封閉后，分別使用Caspase-3、NF-κB p65、NF-κB p-p65的一抗進行過夜孵育，充分漂洗后孵育二抗，進行顯影和蛋白水平的半定量分析。以GAPDH作為內參。

2 結 果

2.1EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠學習記憶能力的影響 與對照組比較，丙泊酚組大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離增加，穿越平臺次數減少(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離減少(P<0.05)，穿越平臺次數增加(P<0.05)；對照組與丙泊酚+EGCG組大鼠在逃逸潛伏期、游泳距離和穿越平臺次數上比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠學習記憶能力的影響

2.2EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織炎癥因子水平的影響 與對照組比較，丙泊酚組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)；對照組與丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織炎癥因子水平的影響

2.3EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織神經營養因子水平的影響 與對照組比較，丙泊酚組大鼠海馬組織中NGF、BDGF水平降低(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中NGF、BDGF水平升高(P<0.05)；對照組與丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中NGF、BDGF水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織神經營養因子水平的影響

2.4EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織細胞凋亡的影響 與對照組比較，丙泊酚組大鼠海馬組織細胞凋亡比例升高(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織細胞凋亡比例降低(P<0.05)。見表4。與對照組比較，丙泊酚組大鼠海馬組織中凋亡因子Caspase-3水平、NF-κB p-p65/p65升高(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中Caspase-3水平、NF-κB p-p65/p65降低(P<0.05)；丙泊酚組與丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織Caspase-3水平、NF-κB p-p65/p65比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表5。

表4 EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織細胞凋亡的影響

圖1 EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織細胞Caspase-3和NF-κB通路蛋白表達的影響

表5 EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織細胞Caspase-3和NF-κB通路蛋白的影響

3 討 論

由于EGCG具有抗氧化和抗炎反應特性，因此近年來它廣泛被用于疾病的防治。EGCG的抗癌作用已在多種腫瘤細胞中得到證實[8]。EGCG已被證實能抑制癌變的諸多過程，如啟動、促進和進展。此外EGCG還被證實能調節多種腫瘤細胞信號通路，如增殖、凋亡、血管生成和遷移等[9]。EGCG也被證實能產生抗肥胖和抗高血糖效應，學者們發現EGCG能抑制脂肪細胞生長和誘導脂肪細胞凋亡[10-11]。研究也發現EGCG能夠對阿爾茲海默病等神經退行性疾病產生積極影響[12]。

丙泊酚是臨床手術常見的麻醉藥物，故它的藥物不良反應也備受關注。研究發現丙泊酚麻醉后會產生不同程度的認知功能損傷，而其損傷程度與年齡相關[13]。本研究通過Morris水迷宮實驗發現一次性注射丙泊酚7 d后大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離增加，而穿越平臺次數減少，提示丙泊酚可誘發大鼠學習記憶能力降低，表明大鼠認知功能損傷模型構建成功。本研究進一步發現連續7 d EGCG治療可減少丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離，并增加其穿越平臺次數，提示短期的EGCG治療即可對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠的學習記憶能力產生顯著的改善效果。

海馬區炎癥反應是認知功能損傷的重要因素，降低海馬區炎癥因子水平也是改善認知功能的重要手段[14]。研究發現，丙泊酚能誘導海馬組織處于高炎癥反應狀態[15]。本研究發現，TNF-α和IL-6是兩個最常見的促炎因子，其在丙泊酚注射后的老年大鼠海馬組織中處于高水平狀態。而經EGCG治療的丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織中TNF-α和IL-6水平接近對照組水平，提示EGCG能抑制丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織高炎癥反應。本研究結果表明，EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠的學習記憶能力的改善與其對海馬組織的抗炎癥反應有關。

NGF是中樞和外周神經細胞生長和發育不可或缺的因子，而NGF既可對海馬組織的結構和功能發揮關鍵調控作用，且NGF也被認為是認知功能損傷的重要標志物[16]。BDGF也是神經營養素家族的關鍵成員。與NGF相比，BDGF主要局限于中樞神經系統，它支持來自神經嵴和外胚層基板的初級感覺神經元的存活，這些神經元對NGF沒有反應[17]。研究也發現，海馬組織中NGF和BDGF水平與認知功能呈高度線性正相關[18]。本研究發現丙泊酚注射的老年大鼠海馬組織中NGF和BDGF水平降低，進一步證實了丙泊酚通過誘導海馬組織損傷引發老年大鼠認知功能損傷。而丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中NGF和BDGF水平高于丙泊酚組，提示EGCG治療后丙泊酚對海馬組織的損傷效應顯著減弱。

海馬組織中凋亡細胞的進行性增多是認知功能損傷的關鍵誘因[19]。本研究發現丙泊酚組海馬組織凋亡細胞比例高于對照組，而Western blott結果也發現Caspase-3作為凋亡誘導因子和細胞凋亡標志物，在丙泊酚組大鼠海馬組織中水平升高，進一步證實了丙泊酚能夠誘發海馬組織細胞凋亡。EGCG治療不僅可降低大鼠海馬組織中凋亡的細胞數量，并且可降低海馬組織中Caspase-3水平，提示EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷的治療效果與其對海馬組織細胞凋亡的抑制有關。

研究表明所有促炎因子的基因都包含NF-κB結合位點，并受其轉錄調控[20]。NF-κB是轉錄因子Rel家族的一員，是由p50和p65亞基組成的異二聚體。不活躍的NF-κB復合物通過與抑制亞單位IκB結合而被隔離在細胞質中。在外界刺激下，IκB蛋白被磷酸化、泛素化和降解，使NF-κB轉運到細胞核，在核內結合位于靶基因啟動子區的特定DNA序列并激活基因轉錄。研究表明NF-κB的激活伴隨著促炎癥細胞因子的分泌，與阿爾茨海默病等諸多神經退行性病變有關，而通過藥物抑制NF-κB水平可以有效緩解神經炎癥從而改善認知功能[21]。本研究發現丙泊酚會誘發老年大鼠海馬組織中NF-κB p-p65/p65升高，而EGCG治療后丙泊酚誘發的NF-κB p-p65/p65被明顯抑制，提示EGCG對丙泊酚誘發的認知功能損傷大鼠海馬組織細胞的抗炎效應與其對NF-κB水平抑制有關。

綜上所述，本研究揭示了EGCG可有效緩解丙泊酚誘發老年大鼠認知功能損傷，而該效應與NF-κB介導的海馬組織細胞炎癥反應和凋亡的抑制及神經營養因子活化有關。