腎細胞癌患者外周血T淋巴細胞表面PD-1水平及臨床意義

林 鋒，張 黎，王彩燕

廈門大學附屬第一醫院血液科，福建廈門 361003

腎細胞癌(RCC)是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年上升，腎透明細胞癌約占所有RCC的80%，是RCC最常見的組織學類型[1-2]。由于RCC對常規的放療、化療不敏感，近年來，對RCC患者進行免疫靶點的治療成為臨床研究中的熱點。T淋巴細胞作為抗腫瘤免疫的主要細胞已被用于RCC的治療[3]。程序性死亡受體-1(PD-1)作為一種重要的免疫抑制分子，當T淋巴細胞表面的PD-1受體與腫瘤細胞表面的程序性死亡配體-1(PD-L1)結合后，會抑制T淋巴細胞殺傷腫瘤的作用[4]。既往有研究表明RCC患者中PD-1高表達能夠導致免疫抑制性腫瘤微環境形成，使腫瘤細胞逃避機體免疫監視，不利于RCC患者的預后[5-6]。增殖細胞核抗原Ki-67是一種反映細胞增殖活性的核蛋白抗原，通過激活細胞周期蛋白依賴激酶2/細胞周期蛋白E通路，加速G1/S期的進程，促進細胞增殖，Ki-67已被證實可作為多種腫瘤細胞的增殖標志物[7]。本研究通過流式細胞術檢測患者外周血T淋巴細胞及其表面PD-1的水平情況，結合增殖細胞核抗原Ki-67水平，分析RCC患者的免疫狀況，以期用靈敏、高效的方法為RCC患者的早期診斷及預后提供可靠依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2021年4月至2022年5月于本院初診為RCC的42例患者(RCC組)的臨床資料，其中男35例，女7例；年齡13～82歲；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期3例；病理分級：Ⅰ～Ⅱ級33例，Ⅲ～Ⅳ級9例；病理類型：透明細胞癌33例，其他類型9例(包括未分類RCC 5例、嫌色細胞癌1例、腎母細胞癌1例、乳頭狀細胞癌2例)；腫瘤位置：左腎18例，右腎24例；選取同期45例體檢健康者作為對照組，其中男32例，女13例，年齡18～69歲。本研究符合《赫爾辛基宣言》，并獲得本院醫學倫理委員會批準，受試者均知情同意。

1.2儀器與試劑 所用熒光單克隆抗體：FITC標記CD4、PE標記CD8；檢測儀器、檢測軟件及數據分析采用美國BD公司的FACSCantoⅡ流式細胞儀、Diva 自動上機軟件。

1.3方法

1.3.1一般資料收集 記錄所有RCC患者的性別、年齡、臨床分期、病理分級、腫瘤最大徑、位置和增殖細胞核抗原Ki-67的水平，分析外周血T淋巴細胞水平及T淋巴細胞表面PD-1水平與臨床病理特征的關系。

1.3.2T淋巴細胞比例及其表面PD-1水平檢測 清晨采集受試者空腹靜脈血3 mL于含肝素鈉抗凝劑的采血管中，處理前充分混勻。在流式管底部加入10 μL PD-1檢測試劑，吸取100 μL混勻的外周血標本，加入管底，避免標本碰到管壁上部；輕輕渦動混勻，室溫避光反應15 min；向管內加入2 mL 1×溶血素，輕輕渦動混勻，室溫避光孵育10 min；300×g離心5 min，棄上清液；向管內加入 2～3 mL磷酸鹽緩沖液，渦動混勻，300×g離心5 min，棄上清液；向管內加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液并完全混合，上機檢測。采用FSC/SSC雙參數設門，獲取1×105個淋巴細胞，根據淋巴細胞膜上CD分子水平的不同，流式細胞儀可以分辨出各種不同的細胞，并計算出CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+。

2 結 果

2.1兩組T淋巴細胞比較 與對照組比較，RCC組CD8+T淋巴細胞百分比升高，CD4+/CD8+降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組CD4+T淋巴細胞百分比比較，差異無統計學意義(P=0.20)。見表1。

表1 兩組T淋巴細胞比較

2.2兩組T淋巴細胞表面PD-1水平比較 與對照組比較，RCC組CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞表面PD-1水平明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 兩組T淋巴細胞表面PD-1的水平比較

2.3外周血T淋巴細胞表面PD-1水平與患者臨床病理特征的關系 RCC患者中，外周血T淋巴細胞表面PD-1的水平與患者的年齡、性別、病理分級、臨床分期、腫瘤最大徑、腫瘤位置、病理類型均無關(P>0.05)，而與組織中Ki-67水平有關，Ki-67水平≥10%的患者外周血T淋巴細胞表面PD-1水平高于Ki-67水平<10%的患者(P<0.05)。見表3。

表3 外周血T淋巴細胞表面PD-1水平與患者臨床病理特征的關系

續表3 外周血T淋巴細胞表面PD-1水平與患者臨床病理特征的關系

3 討 論

腫瘤微環境中炎癥細胞的浸潤和免疫分子的調節對腫瘤的發生、發展至關重要，腫瘤微環境包括由CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞在內的腫瘤浸潤淋巴細胞組成[8]。RCC被認為是一種免疫原性腫瘤，腫瘤微環境中免疫細胞浸潤是RCC預后的重要因素[9]。目前關于RCC免疫功能的研究不多且說法不一，有研究報道RCC腫瘤組織中CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的高度浸潤與腫瘤較高的分級和較短的患者生存期有關[10]。有研究表明，增加CD4+腫瘤浸潤T淋巴細胞的數量，聯合抗PD-1治療能夠緩解RCC患者病情[11]。因此，深入研究RCC患者的免疫細胞及免疫檢查點對RCC的診斷治療意義重大。本研究結果表明，RCC組外周血CD8+T淋巴細胞百分比較對照組明顯升高，CD4+/CD8+較對照組明顯降低，RCC患者外周血中存在T淋巴細胞水平失衡，提示RCC患者處于免疫抑制狀態。

PD-1屬于免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜蛋白，為CD28/細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4/誘導性共刺激分子受體家族的成員，主要表達于腫瘤浸潤T淋巴細胞表面[12]。近年來研究發現，PD-1除了可以在腫瘤組織表達外，還以可溶性形式存在于外周血中[13]。由于腫瘤組織標本來源困難不能實現多次檢測，動態觀察的目的，因此，通過檢測腫瘤患者外周血PD-1水平反映患者的免疫狀態至關重要。本研究發現，RCC組外周血T淋巴細胞表面PD-1水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。通過對RCC患者PD-1水平的多次動態監測，有助于臨床醫生對患者病程進展、治療方案及效果做出及時準確的評估。

Ki-67作為一種評價細胞增殖的核抗原，其水平指數可以獨立預測癌癥的進展。既往研究認為Ki-67在RCC患者中的預后預測價值較高，高水平Ki-67的RCC患者具有較高的臨床病理分級及較短的生存期[14]。Ki-67可促進腫瘤細胞增殖，而過快的腫瘤細胞增殖可促進腫瘤微環境中糖酵解產生的乳酸堆積，從而致使調節性T淋巴細胞上的PD-1水平升高[15]。本研究結果表明，Ki-67水平≥10%的患者外周血T淋巴細胞表面PD-1水平高于Ki-67水平<10%的患者(P<0.05)，預示著二者聯合檢測能更好地預測RCC的進展和分期。Ki-67通過參與細胞周期調控來促進腫瘤增殖，而PD-1/PD-L1軸可通過磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路調節腫瘤細胞的增殖、分化[16]。因此，PD-1與Ki-67對腫瘤細胞的增殖調控是否存在潛在聯系值得進一步探討。

綜上所述，RCC患者外周血中存在CD8+T淋巴細胞百分比升高，CD4+/CD8+降低；RCC組PD-1水平的升高與腫瘤組織中Ki-67水平有關。外周血T淋巴細胞及其表面PD-1水平檢測可以更好地幫助判斷RCC患者的免疫狀態及預后。但本研究存在一定的局限：RCC組的臨床分期Ⅲ～Ⅳ期數量太少，一定程度上影響統計結果；期待后期大樣本研究能更好地呈現外周血T淋巴細胞表面PD-1水平與患者臨床病理特征的關系。